Enzymy-I.kol.oprac.doc

1)      Budowa i funkcje centrum aktywnego

Centrum aktywne enzymy

·         jest to obszar cząsteczki enzymu, w którym cząsteczka(i) substratu zostaje związana i poddana katalizowanej reakcji,

·         ma budowę trójwymiarową, leży w zagłębieniu cząsteczki E niedostępnym dla wody

·         stanowi tylko niewielką część cząsteczki enzymu

Aminokwasy centrum aktywnego

·         k – aminokwasy kontaktowe – leżą w odległości 0,2 nm od substratu; biorą udział w wiązaniu substratu z enzymem oraz bezpośrednio udział w katalizie,

·         p – aminokwasy pomocnicze – nie stykają się z substratem, lecz pełnią określoną rolę w katalizie,

·         s – aminokwasy stabilizujące strukturę przestrzenną centrum aktywnego.

2)      Energia aktywacji

Energia aktywacji jest to najmniejsza ilość energii, którą trzeba dostarczyć 1M substratów aby każda z cząsteczek stała się reaktywna.

Reagują bowiem tylko te cząsteczki które znajdują się na odpowiednio wysokim poziomie energetycznym, czyli te które są w stanie aktywnym.

Różnica pomiędzy podstawowym poziomem energetycznym a poziomem odpowiadającym stanowi aktywacji [GA] zwana jest barierą energetyczną.

Po jej pokonaniu następuje reakcja, w czasie której wydziela się energia będąca różnicą stanów energetycznych substratu i produktu.

3)      Kopolimeryzacja

Specyficzny sposób sieciowania. Obejmuje 2 etapy:
I etap - polega na modyfikacji enzymów zawierających podwójne wiązania (najczęściej pochodna kwasu akrylowego i metakrylowego)
II etap - to proces kopolimeryzacji zmodyfikowanych enzymów przy użyciu takich związków jak np. akrylamid, metakryloamid, N-winylopirolidan
Enzymy posiadające liczne funkcjonalne grupy wykorzystywane w reakcjach wiążących je z nośnikami lub z odczynnikami stosowanymi do sieciowania.
Nie mogą to być natomiast grupy kontaktowe centrum aktywnego enzymu. W celu ich zabezpieczenia przeprowadza się immobilizację w obecności substratów lub ich analogów, które po procesie można usunąć.

4)      Powinowactwo enzymu do substratu

Enzymy charakteryzują się zwykle dużą specyficznością pod względem katalizowanej reakcji, jak i również konwertowanych substratów. Za wysoką specyficzność odpowiada kształt cząsteczki enzymu dopasowany do substratów geometrycznie, ale także pod względem oddziaływań hydrofobowo-hydrofilowych oraz elektrostatycznych. Enzymy wykazują także wysoki poziom stereospecyficzności, regioselektywności i chemoselektywności[27].

Niektóre z enzymów zaangażowanych w kopiowanie i ekspresję informacji genetycznej, poza bardzo wysoką specyficznością i precyzją, wykazują także zdolność działania "korekcyjnego" (ang. reading-proof activity). Przykładem może być polimeraza DNA I, która katalizuje syntezę nici DNA w czasie jej replikacji i naprawy[28]. Polimeraza ta nie tylko jest wysoce precyzyjna, ale i zdolna do natychmiastowej poprawy ewentualnie zaistniałego błędu (źle wbudowanego nukleotydu). W rezultacie, dzięki tym dwóm właściwościom (precyzja syntezy i korekcja błędów), ryzyko popełnienia błędu przez ssacze polimerazy, który nie zostanie zauważony w procesie syntezy, wynosi mniej niż jeden na miliard wprowadzonych nukleotydów[29]. Podobne mechanizmy korekcyjne posiadają polimerazy RNA[30], syntetazy aminoacylo tRNA[31] i rybosomy[32].

Z kolei niektóre enzymy uczestniczące w produkcji metabolitów wtórnych charakteryzują się stosunkowo szerokim zakresem akceptacji różnych substratów. Sugeruje się, że odgrywają one bardzo ważną rolę w ewolucji nowych szlaków metabolicznych

5)      inhibicja odwracalna

1)      Odwracalna              - kompetycyjna

- niekompetycyjna

- akompetycyjna

- mieszana

INHIBICJA KOMPETYCYJNA (WSPÓŁZAWODNICZĄCA)

·         inhibitor kompetycyjny zmniejsza szybkość katalizy enzymatycznej przez zmniejszenie liczby cząsteczek enzymu wiążących substrat,

·         inhibicję kompetycyjną można znieść przez zwiększenie stężenia substratu

·         Vmax nie ulega zmianie, zwiększa się Km

INHIBICJA NIEKOMPETYCYJNA (NIEWSPÓŁZAWODNICZĄCA)

INHIBITOR NIEKOMPETYCYJNY

·        wiąże się w miejscu katalitycznym (nie w miejscu wiązania substratu) lub poza nim, wywołując zmiany konformacyjne niekorzystne dla miejsca katalitycznego

·        inhibitor nie jest strukturalnie podobny do substratu, nie może wiązać się w miejscu wiązania substratu, tylko w miejscu katalitycznym lub poza nim => obniża szybkość maksymalną katalizy

·        zmniejsza szybkość katalizy enzymatycznej poprzez zmniejszenie liczby obrotów enzymu (obniża stężenie funkcjonalnego enzymu, pozostała część funkcjonalnego enzymu zachowuje się jak bardziej rozcieńczony roztwór enzymu)

·        inhibitor niekompetycyjny nie wpływa na przyłączanie substratu do enzymu – nie wpływa na powinowactwo E do S

·        nie zmienia Km, obniża Vmax

Nie można znieść inhibicji niekompetycyjnej zwiększając stężenie substratu, lecz poprzez związanie inhibitora przez inny związek

INHIBICJA AKOMPETYCYJNA

INHIBITOR AKOMPETYCYJNY

·        wiąże się w innym miejscu niż miejsce wiązania substratu, wiąże się do kompleksu ES tworząc nieaktywny katalitycznie kompleks ESI

·        związanie substratu przez enzym odsłania miejsce wiązania inhibitora

·        obniża Vmax i Km

·        nie można go znieść przez zwiększenie stężenia substratu

Ten typ inhibicji jest dość rzadki i może dotyczyć niektórych enzymów multimerycznych, katalizujących reakcje z udziałem wielu substratów.

INHIBICJA MIESZANA

inhibitor może wiązać się do E lub kompleksu ES

·        nie ważne założenie o niezależności miejsc wiązania S i I, tak jak w inhibicji niekompetycyjnej

·        inhibitor może się wiązać w centrum aktywnym (miejscu wiązania substratu lub miejscu katalitycznym) lub poza nim

·        inhibitor wpływa jednocześnie na wiązanie substratu, jak również liczbę obrotów enzymu

6)      Enzymy oligomeryczne

Enzymy oligomeryczne

·         składają się z 2 lub więcej podjednostek,

·         podjednostka jest to element oligomeru łączący się z innymi wyłącznie wiązaniami nikowalencyjnymi,

·         podjednostka może się składać z 1 łańcucha polipeptydowego lub kilku połączonych wiązaniami kowalencyjnymi,

·         masa oligomeru pow. 35 kDa – 1000 kDa, zdarza się do 10000 kDa

·         np. oksydaza glukozy (homodimer – 2 identyczne podjednostki katalityczne), heksokinaza (heterodimer – 2 różne podjednostki).

W skład enzymów oligomerycznych mogą wchodzić podjednostki regulatorowe (nie mające centrum aktywnego), na których znajdują się centra allosteryczne, do których przyczepiają się aktywatory i inhibitory.

7)      Efektor allosteryczny

Allosteryczne efektory - Nie zawsze tworzą kompleksy, które podlegają dalszym zmianom, ale zmieniają konformację enzymu – wpływają na jego powinowactwo do substratu

Kinetykę enzymów allosterycznych opisuje model sigmodalny

Zależność sigmoidalna jest wynikiem kooperatywnego wiązania substratu. Związanie substratu do jednego miejsca aktywnego może zmieniać powinowactwo innych miejsc aktywnych enzymu – na ogół zwiększenie powinowactwa

8)      Wpływ pH i temp na reakcję enzymatyczną

Wpływ temperatury

Działa na cząsteczki S i E.

­ temp. => ­ En. kinetycznej cz. S

Cząsteczki substratu szybciej się poruszają, zderzają się częściej, więcej z nich może osiągnąć stan przejściowy.

W pewnym momencie osiągnięta zostaje temp. optymalna dla działania enzymu.

Temperatura optymalna – temperatura, przy której szybkość reakcji enzymatycznej biegnie z maksymalną szybkością, a nie ma miejsca jeszcze denaturacja białka enzymatycznego.

Zbyt wysoka temperatura powoduje drgania w cząsteczkach enzymu i dochodzi do rozerwania wiązań w enzymie.

Wpływ pH

pH środowiska wpływa na:

wiązanie substratu przez E, aktywność katalityczną E, stan jonizacji substratu, zmiany w strukturze przestrzennej E.

pH wpływa na stopień zdysocjowania (uprotonowania):

·        grup funkcyjnych centrum aktywnego,

·        grup funkcyjnych, które uczestniczą w katalizie,

·        grup funkcyjnych substratu, które uczestniczą w wiązaniu do enzymu,

·        grup funkcyjnych leżących w pobliżu centrum aktywnego, które decydują o konformacji tego centrum aktywnego.

Optymalne pH działania – wartość pH, przy której szybkość katalizowanej reakcji jest maksymalna.

Krzywe zależności v/pH mogą być też prostolinijne.

Niewielkie odchylenie pH od wartości optymalnych powoduje nagły spadek szybkości reakcji enzymatycznej.

9)      Kompleksy wieloenzymowe

·         KOMPLEKSY WIELOENZYMOWE

W formie

- rozpuszczalnej

- związanej z błonami

- związanej ze strukturamu subkomórkowymi

Enzymy w nich występujące katalizują sprzężone ze sobą reakcje chemiczne. Działają w sposób bardzo ekonomiczny: reakcje mogą przebiegać przy niższym stężeniu substratu, zapewniona jest:

- maksymalna szybkość reaktywacji koenzymów i

- regulacja procesu.

Asocjacja enzymów tworzących kompleks ma charakter bardzo swoisty podobnie jak podjednostek w oligomerach.

Kompleksy te cechuje jednak

- regularna i zwarta budowa geometryczna oraz

- duża trwałość.

Oddzielone enzymy stają się nieaktywne.

10) Reaktywność enzymów

Jeśli chodzi o reaktywność to trzeba napisać co to jest katalityczna Kcat.

Kcat- stała katalityczna, jest miarą reaktywności enzymu czyli jego zdolności do katalizowania reakcji. Charakteryzuje ona przebieg reakcji w etapach następujących po utworzeniu kompleksu E-S, aż do rozpadu z uwolnieniem produktu.
Kcat określa więc liczbę moli substratu przetworzonego przez 1 mol enzymu w czasie 1s w warunkach, w których enzym wykazuje maksymalną aktywność.

11) Wymień i scharakteryzuj etapy reakcji enzymatycznej.

Trzy zasadnicze etapy reakcji enzymatycznej

Etap pierwszy

związanie cząsteczek substratu na powierzchni enzymu, powstanie kompleksu ES

Etap drugi

oddziaływanie S i E polegające na przegrupowaniach elektronowych pomiędzy grupami funkcyjnymi S i grupami funkcyjnymi aa kontaktowych E, naprężeniach wiązań w substracie

→ wzbudzonej formy kompleksu E-S

→ E-S‡ „utworzenia stanu przejściowego”

Etap trzeci

zajście reakcji katalitycznej, przekształcenie kompleksu E-S w kompleks E-P i rozpad tego ostatniego na E i P

12) czterocyfrowa klasyfikacja enzymów

Zgodnie z zaleceniami Komisji Enzymowej, po nazwie zwyczajowej należy podawać czterocyfrowy symbol klasyfikacyjny enzymu np.

dehydrogenaza alkoholowa EC 1.1.1.1 (enzym ten nosi nazwę systematyczną oksydoreduktaza alkohol: NAD i katalizuje reakcję):

Alkohol + NAD = aldehyd lub keton + NADH + H+

Pierwsza cyfra wskazuje na przynależność enzymu do jednej z głównych 6 klas. Są to:

1.       Oksydoreduktazy – reakcje oksydoredukcyjne

2.       Transferazy – przenoszenie określonych grup pomiędzy związkami

3.       Hydrolazy – rozkład różnych wiązań z udziałem cząsteczki wody

4.       Liazy – odłączenie różnych grup od substratu bez udziału wody

5.       Izomerazy – reakcje izomeryzacji

6.       Ligazy [syntetazy] – wytwarzanie wiązań pomiędzy atomami w cząsteczkach substratów.

Druga cyfra dotyczy podziału na podklasy określające:

W klasie 1 i 2 – rodzaj grupy, której dotyczy reakcja,

W klasie 3, 4, 6 – typ wiazania rozrywanego lub tworzonego,

W klasie 5 – rodzaj izomeryzacji.

Trzecia cyfra wskazuje przynależność do odpowiedniej pod-podklasy grupującej enzymy:

- działające na określone grupy substratów lub

- działające w obecniści określonych akceptorów

- a w przypadku enzymów proteolitycznych – posiadające specyficzne centrum aktywne.

Czwarta cyfra jest numerem porządkowym enzymu w danej pod-podklasie

13) Swoistość substratowa

Wybiórczość substratowa polega na tym, że:

- enzym szczególnie aktywnie katalizuje przemianę związku zawierającego oprócz grupy reagującej również inne grupy funkcyjne, a brak tych grup albo zablokowanie ogranicza ewentualnie eliminuje działanie enzymu lub

- enzym działa tylko na jeden z izomerów optycznych danego związku ( stereoswoistość) lub

- enzym jest szczególnie aktywny wobec związków o określonej długości łańcucha węglowego.

14) Immobilizacja w układach dwufazowych

IMMOBILIZACJA ENZYMÓW LUB KOMÓREK

- zespół metod umożliwiających unieruchomienie enzymów lub całych komórek w wyniku ich związania na powierzchni nośnika (adsorpcja, wiązania kowalencyjne), zamknięcie w porach żelu lub kapsułkach z półprzepuszczalnych błon bąd...