PCR
amplkon-produkt reakcji pcr
RAPD PCR - wykorzystywany gdy nie zamy sekwencj starerw, zaprzecza wszystkim znanym zasadm o PCR
· polimorfizm losowo amplifikowanych fragmentow DNA, DNA amplifikowane jest przy uzyciu jednego wybranego startera (dlugosc max 10 nukleotydow, zawartosc par G/C musi byc w granicach 50-80%, nie moze zawerac sekwencji palindromowych)
· przebieg: po denaturacji helisy DNA, nastepuje hybrydyzacj nici DNA ze starterem - w ej czasie nasz starter moze przylaczyc sie w wielu miejscach, pozniej nastepuje elongacja starterow, ale namnozy sie tylko taki fragment, ktory jest zamniety starterem z obu stron.
· po amplifikacji z wybrnym starterem otrzymujemy kilka do kilkunastu prazkow roznej dlugosci da danego osobnika
· jakosc danego produktu jest nam nieznana
· sluzy do zgrubnej identyfikacji gatunkow/szczepow bakterii dotad nam nie znanych
· wada: mala powtarzalnosc, wynik reakji zalezy od stosowanych narzedzi
Nested PCR (zagniedony PCR) - zastosowany przy niespecyficzne amplifikacji okreslonego fragmentu, najpierw przeprowadzay reakcje pcr na DNA jadrowym, pozniej na produkcie pierwszego PCR
· pierwszy starter przylacza sie bardzo specyficzne drugi starter przylacza sie gdzies
· otrzymujemy niespecyficzne produkty reakcji PCR, ktorych trzeba sie pozbyc, nic nie moze byc poza produktami secyficznymi PCR
· co robimy z niespecyficznymi - dodajemy druga pare starerow, ktora bedzie hybrydyzowala w obrebie pierwszyc starterow
· wada: zawsze otrzymamy produkt krotszy, niz zakladany
· kiedy: startery od innego gatunku
Multipleks PCR - wykorzystywany do ednoczesnej amplifikacji wielu fragmentow, w rekcji stosuje sie do 20 par starterow znakowanyh fluorescencyjnie (kiedy: typowy figerpriting)
-kiedy nie wyjdzie nam normalne PCR, robimy Multipleks PCR
· mamy wiecej produktow procesu
· dokladamy startery
· co kiedy dwa fragenty maja zbizona dlugosc? - w reakcji multipleks startery powiny byc znakowane (czyli do jego konca 5' przylaczamy fluorochrom)
· wykonujemy inny rodzaj elektroforezy
Allelo - specyficzny PCR - wykorzystywany do mutacji punktowych SNP, pozwala namnozyc inny ragment w zaleznosci od zaistnienia mutacji, stosuje sie trzy startery - w reakcji obserwujemy produkt, badz jego brak, mamy znakowanie fluoresencyjne
· ten typ reakcji wykonujemy, kiedy wiemy wszystk o matrycy
· wykorzystywany w diagnostyce
· starter 3 - neutralny, starter 1 i 2 zalezny od mutacji
· otrzymane produkty PCR sa wybarwione
· modyfikacja startera - przylacznie fluorochromu do konca 5' startera
Real Time PCR - wykorzystywany obserwowania przyrostu produktu PCR w czasie, pozwala na wykrycie amplifikacji na kilku kopiach matrycy - mozemy podejrzec w czasie trwania reakcji ile amplikonu powstaje w jakim czasie - NIGDY nie skracamy nazewnictwa tej reakcji
· inerkalacja - SYBR green
o specyficznosc reakcji zalezna jest od starterow
o nie umozliwia przeprowadzenia reakcji typu multipleks - bo emituje zawsze jedna dugsc fali, czyli mamy jeden kolor
o umozliwia zabserwowane dodatkowych produktow - przy niespecyficznych starterach
o zfalszowanie w odczycie fluorescencji (dimery, wszystkie dwuniciowe konformacje) - wielkosc wykrywanych produktow dla roznych genow musi byc bardzo zblizona
o SYBR green bedzie interkalowal z nowopowstalymi czastkami DNA
o bardzo tanio
o primer dimer - produkt reakcji dwoch starterow hybrydyzujacych ze soba - SYBR nie roznicuje, wiec moze byc bledny odczyt
· Transfer energii rezonansu fluorescencji (FRET)
o moze dzialac albo przeniesieniem emisji, albo wygaszenie
o przeniesienie emisji - fluorochrom pierwszy (donor) w wyniku wzbudzenia fala swietlna, przenosi energie na fluorochrom drugi (akceptor), ktory emituje kwant siatla o innej dlugosci, sonda - musi hybrydyzowac blisko startera (w tym procesie mamy dwa sartery i sonde); przyrost swiecenia - z kzdym cyklem zieksza sie ilosc miejsc hybrydyzacji
o wygaszenie emisji - Sondy - TaqMan, donor jest wygaszany przez akceptor, ktory pochlania emiscje fali donora, wzbudznie emisji nastapi doiero po odlaczeniu reortera od wygaszacza, podczas proesu elongacji
o metoda droga
o bardzo specyficzna - swiecenie jest zwiazane z amplifikacja, czyli przybywanie produkcji PCR
*odwrotna transkrypcja - syntezowanie nici DNA na posiadanym mRNA* a propos RT-PCR
Inverse PCR - pozyskanie sekwencji, kiedy nie jestesmy w stanie pozyskac do niej starterow
Long PCR - zadniem tego procesu jest otrzymanie jak najdluzszego fragentu (do 40 tys pz)
RODZAJE KONTROLI PCR
· NTC - bez matrycy
- kontrola czystosci odczynnikow do reakcji PCR (normalna reacja tylko bez amplikonu)
· PC - kontrola pozytywna
- kontrola wlasciwego przebiegu reakcji PCR
- fragment DNA, ktory powinien sie zawz w reakci zamplifikowac
- nie mozna stosowac tej metody w przypadku dagnostyki drobnoustrojow
· IPC - wewnetrzna kontrola pozytywa
- kontrola wasciwego przebiegu reakcji PCR, stosowana alteratywnie do PC
- kawalki syntetycznego DNA nieszkodliwego i dolazone do niego sartery - musi sie w kazdej reakcji zamplifikowac
· NAC - bez amplifikacji
- kontrola z inhibitorem (wszytki reagenty oraz matryca + inhibitor reakcji np.etanol) - konrola jakosci matrycy, czytosci platikow oraz sprzetu - jezeli zobaczyy coklwiek w zelu agarozowym, to znaczy, iz np. mamy brudne probowki, albo zaieczyszczony sprzet
xkathyx249