Techniki w biologii molekularnej 20.11
Praktyki, praktyki, praktyki, praktyki
ENYMY RESTTRYKCYJNE
· enzymy z klasy endonukleaz (hydrolaz), wykazuje powinowactwo do speyficznych fragntow dwuniciowych czasteczek DNA i hydrolizuje wiazana fosfodiestrowe w obu niciach - enzym, ktory utworzy kompleks z DNA wtedy, i tylko wtedy, kiedy rozozna konkretna sekwencje DNA
· naturalnie produwane sa przez bakterie (ich rola jest "wycinanie" DNA bakteriofagow)
· aktywnosc enzymu wyrazona jet w jednostce aktywnosci enzymu restrykcyjnego (U) to taka jego ilosc, ktora trawi kopletnie 1 mg DNA faga [lambda] (okolo 50 kb) w czasie 1 godz. w temperaturze 37 st
nazewnictwo: EcoRV
- pierwsza litera - rodzaj bakterii
- druga i trzecia - gatunek
- nastepna litera oznacza szczep lub typ
- kolejne enzymy izolowane z danego szczepu lub typu otrzymuja cyfry rymskie
np. Escherichia coli, szczep RY13, piaty enzym wyizolowany z tego szczepu
Czym rozniasie poszczegolne enzymy?
· budowa, miejscem utworzenia kompleksu z DNA po ropozaniu sekwencji raz mechanizmem enzymatycznym
· rozpoznawna sekwencja (jej dlugoscia i sladem nukleotydowym)
· miejscem hydrolizy w obrebie sekwencji
TYP I
Enzymy zbdowane z trzech podjednostek struturalno - funkcjonalnym
· podjednostka S - rozpoznaje Sekwecje DNA
· podjednostka M - Modyfiuje DNA
· podjednostka R - posiada aktywnosc Restrykcyjna
Kompleks podjednostek R2M2S1 jest enzymem restrykcyjnym,gdy napotka niezmodyfikowany DNA - podjednostki S i M tworza metylaze, ktora rozpoznaje i modyfikuje DNA w obrebie okreslonej sekwencji, czyli metylacja DNA przed dzialaniem enzymu
Wymaga ATP i S-adenozylo-L-metioniny.
Ciecie nastepuje w roznych niezdefiniowanych odleglosciach od miejsca rozpoznania, zwykle kilkase do kilku tysiecy par zasad.
TYP II
Eznymy, ktorych aktywnosci metylazy i endonuleazy rozdzieone sa miedzy dwa odrebne bialka kodowane przez rozne geny - nie metyluja nici DNA przed trwieniem
· nie wymaga ja obecnosci ATP
· ale bardzo potrzebuja MgCl2 - magnez wyplywa na tworzenie sie kompleksu enzymu z helia DNA
· trawia DNA w brebie sekwencji rozpoznania lub w nieduzej, scisle okreslonj odlugosci od niej, dajac na ogol powarzalne produkty trawienia (maja dbre hamulce)
· rozpoznaja krotki, najczesciej palindromiczne sekwencje 4-8 pz
· wyroznia sie kilka klas w obrebie typu
o homodimery rozpoznaja sekwencje asymetryczne, trawia w odeglosci 1-20 pz od mejsca rozpoznania
o homotetramery rozpoznaja sekwencje asymetryczne, trwia w miejscu rozpoznania
TYP III
Enzymy zbudowane z dwoch podjednostek strukturalno - funkcjonalnych
· podjednostka M - modyfikuje DNA
· podjednostka R - posiada aktywnosc retrykcyjna
Kompleks podjednostek R2M2 jest enzymem restrykcyjnym wymagaacym do aktywnosci ATP i S-adenozylo-L-metioniny
Podzial ze wzgleu na rozpoznawane sekwencje
- sekwencje czteronukleotydwe - moze trawic DNA co 256 pz (4^4)
- sekwencje szescionuleotydowe - moze trawic DNA co 4096 pz (4^6)
- sekwencje osmionukleotydoowe - moze trawic DNA co 4^8
- sekwencje niespecyficne - wykazuja znacnie wiecej miejsc restrykcyjnych nz enzymy rozpoznajae sekwencje specyficzne
Podzial ze wzgledua same trawienie/miejsce hydrolizy:
- enzymy hydrolizujace obie nici DNA w tym samym miejscu - tepe konce (blunt ends) - jakby ciachnal ktos nozyczkami, ciezko je potem ze saba polaczyc
- enzymy hydrolizujace kaza z nici DNA w inym miejscu - powstaja lepkie konce 3' (sticky ends) - szybko je mozna potem ze soba polaczyc
- neoschizomery - rozpoznaj taka sama sekwencje DNA lecz przeciaja ja w inny sposob np SmaI, XmaI
NIESPECYFICZNA AKTYWNOSC (STAR ACTIVITY)
· aktywnosc niespecyficzna, pojawia sie gdy warunki reakcji znacznie roznia si od optymalnych, efete jest zmiana spcyficznosci enzymu
· wysoka koncetracja glicerolu ww mieszaninie reakcyjnej - enzym nie trawi
· wysokie stezenie enzymu
· niezoptymalizowany bufor (zasadowe ph, za wysoka wartosc jonow)
· przedluzony czas reakcji enzymatycznej - przeprowadzane w ak najkrotszmczasie
· obecnosc zwiazkow organicznych takih jak: DMSO, etanol, glikol etylenowy
· zastapienie (lub zwiekszona koncentracja0 jonow magnezu innymi dwudodatnimi jonami: Mn, Cu, Co lub Zn
· gicerol - zawiesza sie w nim enzymy do przechowywani ( mrozimy ale nie zamarzaja)
· DMSO - wplywa na zywotoc enzymu
xkathyx249