wektory.pdf

(1130 KB) Pobierz

POST. MIKROBIOL.,

2011, 50, 1, 316

http://www.pm.microbiology.pl

ZASTOSOWANIE WEKTORÓW BAKTERYJNYCH

W BIOLOGII MOLEKULARNEJ I W MEDYCYNIE

Ma³gorzata Joanna Staworzyñska

, Rados³aw Stachowiak

*, Jacek Bielecki

Zak³ad

Mikrobiologii Stosowanej, Instytut Mikrobiologii, Wydzia³ Biologii UW

ul. Miecznikowa 1, 00-096 Warszawa

Wp³ynê³o w listopadzie 2010 r.

1. Wprowadzenie. 2. Zastosowania wektorów bakteryjnych. 2.1. Wektory jako podstawowe narzêdzie do klonowania. 2.1.1. Kla-

syczne wektory. 2.1.2. Wektory komercyjne, nowe strategie. 2.2. Wektory s³u¿¹ce do przenoszenia genów miêdzy organizmami.

2.2.1. Transport genów do komórek eukariotycznych. 2.3. Wektory ekspresyjne. 2.3.1. Nadprodukcja bia³ek. 2.3.2. Cechy, które

powinien spe³niaæ wektor ekspresyjny. 2.3.3. Przyk³ady wektorów ekspresyjnych. 2.3.4. Produkcja insuliny. 2.3.5. Produkcja szcze-

pionek nowej generacji. 2.4. Wektory nios¹ce geny reporterowe. 3. Podsumowanie

Applications of bacterial vectors in molecular biology and medicine

Abstract:

Bacterial vectors are DNA molecules, that are the basic tool of genetic engineering. They are used as vehicles to transfer

and multiply foreign DNA in a target organism. They allow to process genetic modifications in organisms by transfer of genes from

one organism to another. Scientists use bacterial vectors to produce proteins, as well as for various types of biological research. The

most important criteria to be fulfilled by vectors are: the possibility of autonomous replication within the host cell, posession of

selection markers and multiple restriction enzyme site (cloning site), that allow to insert the DNA fragment. Today it is technically

possible to construct vectors containing many different properties such as: type of host range, size of DNA fragment that can be

inserted into a vector, number of vector copies in the target cell and many types of marker genes that allow to differ between

recombinated and not recombinated cells. The most commonly used vectors are plasmids.

1. Introduction. 2. Applications of bacterial vectors. 2.1. Vectors as basic tool for DNA cloning. 2.1.1. Convential vectors.

2.1.2. Commercial vectors, new strategies. 2.2. Vectors as a tool for gene transfer between organisms. 2.2.1. Gene transfer

to eucaryotic cells. 2.3. Expression vectors. 2.3.1. Protein overexpression. 2.3.2. Properties of a succesfull expression vector.

2.3.3. Examples for expression vectors. 2.3.4. Production of insulin. 2.3.5. Production of new generation vaccines. 2.4. Vectors with

reporter genes. 3. Summary

S³owa kluczowe:

klonowanie, nadprodukcja bia³ek, wektor bakteryjny

Key words:

cloning, protein overproduction, bacterial vectors

1. Wprowadzenie

Stosowanymi w biotechnologii wektorami s¹ ró¿-

nego rodzaju noniki DNA, które wykorzystuje siê

w celu klonowania genów i ich wprowadzania do ko-

mórek drobnoustrojów gospodarzy [24]. Je¿eli uda³oby

siê wprowadziæ do komórki dowolnego organizmu

niczym niechroniony fragment DNA, to wkrótce

zosta³by on strawiony do pojedynczych nukleotydów.

Natomiast wektory pozwalaj¹ nie tylko na wprowa-

dzenie fragmentu DNA, ale maj¹ równie¿ zdolnoæ

do autonomicznej replikacji w danym typie komórek

i dziêki temu zapewniaj¹ powielanie wprowadzonego

fragmentu DNA oraz umo¿liwiaj¹ ekspresjê genów

w nim zawartych [48].

Do czasów opracowania metod in¿ynierii gene-

tycznej pewne manipulacje polegaj¹ce na wyodrêb-

nianiu genów i ich przenoszeniu z jednej komórki do

drugiej mia³y bardzo ograniczony zasiêg. Ekspery-

menty wykonywano jedynie na bakteriach, wykorzys-

tuj¹c bakteriofagi i metodê transdukcji. Dopiero wpro-

wadzenie metody rekombinacji i klonowania DNA

pozwoli³o na przenoszenie materia³u genetycznego na

wiêksz¹ skalê. G³ówne etapy takiego dowiadczenia,

przedstawiono na rys. 1.

Polegaj¹ one na wyizolowaniu fragmentu DNA,

który ma zostaæ sklonowany, pofragmentowaniu DNA

przy u¿yciu enzymów restrykcyjnych, po³¹czeniu frag-

mentów DNA z wektorem za pomoc¹ ligazy i wprowa-

dzaniu cz¹steczek rekombinowanego DNA do komórek,

w których ulegaj¹ one powieleniu [48]. Nastêpnie

przeprowadza siê selekcjê klonów komórek zawiera-

j¹cych zrekombinowany DNA, aby mo¿na praktycz-

nie wykorzystywaæ w ten sposób otrzymane klony. Do

klonowania stosuje siê g³ównie dwa rodzaje wek-

torów: plazmidowe (pochodzenia bakteryjnego) i po-

chodzenia wirusowego. W tej pracy skoncentrowano

siê g³ównie na wektorach pochodzenia bakteryjnego.

We wspó³czesnej biotechnologii rekombinowane

szczepy drobnoustrojów wykorzystywane s¹ bardzo

* Autor korespondencyjny: Zak³ad Mikrobiologii Stosowanej, Instytut Mikrobiologii, Wydzia³ Biologii UW; ul. Miecznikowa 1,

00-096 Warszawa; tel. 22 554 41312; e-mail: radeks@biol.uw.edu.pl

ZASTOSOWANIE WEKTORÓW BAKTERYJNYCH W BIOLOGII MOLEKULARNEJ I W MEDYCYNIE

Rys. 1. Ogólny schemat klonowania

Wektor zawiera miejsce inicjacji replikacji (ori), marker selekcyjny (np. gen opornoci na antybiotyk) oraz miejsce MCS (multiple cloning site), które

jest sekwencj¹ DNA zawieraj¹c¹ wiele miejsc rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne. Zarówno wektor oraz klonowany fragment DNA trawione

s¹ odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi (symbol no¿yczek na rysunku), które pozostawiaj¹ kompatybilne koñce. Nastêpnie przeprowadzana

jest ligacja obu fragmentów.

czêsto jako narzêdzia produkcyjne. Znajduj¹ one za-

stosowania w laboratoriach gdzie mog¹ byæ u¿ywane

w celu poznawania funkcji genów lub bia³ek ró¿nych

organizmów. W medycynie szczególnie wa¿nym osi¹g-

niêciem jest wykorzystywanie szczepów rekombino-

wanych do biosyntezy bia³ek lub hormonów ludzkich,

które maj¹ du¿e znaczenie terapeutyczne. Coraz czê-

ciej s³yszy siê te¿ o wykorzystywaniu technik rekombi-

nacji DNA do otrzymywania rekombinowanych szcze-

pionek, które stosuje siê do szczepieñ ochronnych

ludzi i zwierz¹t [24].

Aby wektor by³ u¿yteczny, powinien spe³niæ kilka

podstawowych warunków. Musi byæ zdolny do auto-

nomicznej replikacji w swoistym gospodarzu i posia-

daæ miejsca restrykcyjne umo¿liwiaj¹ce odpowiednie

wstawienie fragmentu DNA. Wektor powinien równie¿

nieæ gen markerowy pozwalaj¹cy na selekcjê, czyli od-

ró¿nienie komórek gospodarza, które pobra³y zrekom-

binowany wektor, od tych, które go nie pobra³y [20].

Obecnie dysponujemy du¿¹ gam¹ wektorów o ró¿-

nych cechach, takich jak zakres gospodarza, wielkoæ

fragmentu DNA (który mo¿e byæ niesiony przez wek-

tor), liczba kopii plazmidu, miejsca rozpoznawane

przez enzymy restrykcyjne, iloæ i typ genów marke-

rowych [20]. Ze wzglêdu na rodzaj gospodarza mo¿na

podzieliæ wektory miêdzy innymi na bakteryjne, grzy-

bowe, komórek ssaków, komórek rolinnych, komórek

owadzich [24]. Wektory mo¿emy te¿ opisywaæ ze

wzglêdu na funkcjê, jak¹ spe³niaj¹ w komórkach go-

spodarza, na przyk³ad wektory ogólnego stosowania

do klonowania genów (np. pBR322, pUC), wektory

u³atwiaj¹ce sklonowanie produktów reakcji PCR

³añcuchowa reakcja polimerazy; polymerase chain

reaction (np. pDrive, TOPO wektory), wektory ekspre-

syjne do efektywnej syntezy bia³ka (np. seria pGEM),

wektory umo¿liwiaj¹ce produkcjê bia³ek ludzkich (np.

zawieraj¹ce gen insuliny).

W niniejszej pracy przedstawiono podstawowe

w³aciwoci wektorów bakteryjnych oraz mo¿liwoci,

jakie daje ich zastosowanie. Opisano zarówno wektory

klasyczne, które jako pierwsze stosowane by³y w bio-

technologii, jak i najnowsze wektory znajduj¹ce obec-

nie zastosowanie w ró¿nych dziedzinach. Wymienione

s¹ równie¿ cechy, jakie powinien spe³niaæ wektor eks-

presyjny oraz pokrótce przedstawiono wykorzystanie

wektorów bakteryjnych nios¹cych geny reporterowe,

umo¿liwiaj¹ce prost¹ obserwacjê ekspresji innych ge-

nów w komórce.

2. Zastosowania wektorów bakteryjnych

2.1. Wektory jako podstawowe narzêdzie

do klonowania

Podstawowym zastosowaniem wektorów bakteryj-

nych jest u¿ycie ich jako narzêdzi do klonowania. Po-

mys³ takiego zastosowania powsta³ wkrótce po tym jak

odkryto istnienie bia³ek przecinaj¹cych DNA w specy-

ficznych miejscach nazywanych enzymami restrykcyj-

nymi. Enzymy restrykcyjne rozcinaj¹ d³ugie cz¹steczki

DNA na specyficzne fragmenty, którymi mo¿na ³atwo

manipulowaæ. Drugim niezbêdnym narzêdziem w la-

boratorium biologicznym s¹ ligazy, czyli enzymy po-

zwalaj¹ce na ³¹czenie fragmentów nici DNA. Ligazy

katalizuj¹ tworzenie wi¹zañ fosfodiestrowych w obsza-

rach zerwania nici DNA przy wykorzystaniu energii

ATP lub NAD

. Zastosowanie enzymów restrykcyjnych

oraz ligaz DNA umo¿liwia wycinanie fragmentów

DNA, a nastêpnie ich ligacjê z DNA nonikowym, czyli

wektorem oraz póniejszy transfer tak zrekombinowa-

nego DNA do komórek bakteryjnych, gdzie mo¿na

tworzyæ ich setki tysiêcy kopii, klonów. To z kolei

umo¿liwia izolacjê sklonowanych fragmentów DNA

na du¿¹ skalê. Du¿e iloci specyficznych sekwencji

DNA mog¹ byæ nastêpnie wykorzystywane do ró¿nych

celów izolacji genów, analizy ich organizacji i eks-

presji, odczytania sekwencji nukleotydowej [2].

MA£GORZATA JOANNA STAWORZYÑSKA, RADOS£AW STACHOWIAK, JACEK BIELECKI

Mo¿liwoæ wyizolowania i sklonowania specyficz-

nych fragmentów DNA otworzy³a nowy rozdzia³

w medycynie genetycznej, biologii molekularnej i ko-

mórkowej oraz w biochemii. Sklonowanie wybranego

fragmentu DNA umo¿liwi³o szukanie mutacji i poli-

morfizmów zwi¹zanych z dan¹ chorob¹, identyfiko-

wanie ekspresji genów w wybranych tkankach oraz

warunków ekspresji genów [28]. Z biegiem czasu

stworzono bardzo wiele wektorów s³u¿¹cych do klono-

wania, które staj¹ siê coraz bardziej wyspecjalizowane,

s¹ zdolne do przenoszenia coraz wiêkszych fragmen-

tów DNA i umo¿liwiaj¹ przeprowadzanie skompliko-

wanych badañ [20].

2.1.1. Klasyczne wektory

Wektor pBR322.

Jednym z pierwszych najlepiej po-

znanych i czêsto wykorzystywanych wektorów bak-

teryjnych by³ plazmid pBR322 (rys. 2). Jest to ma³y

plazmid (4366 pz), który zosta³ skonstruowany przez

B o l i v a r a i R o d r i g u e z a w 1976 roku. Mo¿na

do niego wstawiaæ fragmenty DNA do 10 kpz [10].

Zawiera on miejsce inicjacji replikacji origin of repli-

cation pozwalaj¹ce na replikacjê w jedynym gospoda-

rzu

Escherichia coli.

pBR322 jest stabilnym plazmi-

dem, normalnie wystêpuj¹cym w iloci 2030 kopii

na komórkê (po dodaniu do pod³o¿a chloramfenikolu

liczba kopii mo¿e wzrosn¹æ nawet do 10003000).

Zawiera dwa geny opornoci: na ampicylinê (w obrê-

bie genu

-laktamazy)

i tetracyklinê. W obrêbie genu

tetracykliny znajduj¹ siê miejsca restrykcyjne

BamHI,

HindIII,

SalI,

natomiast w obrêbie genu opornoci

na ampicylinê miejsce restrykcyjne

PstI.

Oprócz tego

plazmid pBR322 zawiera te¿ miejsce restrykcyjne

EcoRI,

poza rejonem koduj¹cego DNA [10].

Plazmid pBR322 sta³ siê prekursorem wielu now-

szych, coraz bardziej doskonalszych wektorów. Udo-

skonalone zosta³y miêdzy innymi metody selekcji klo-

nów zawieraj¹cych zrekombinowany DNA, dodano

nowe miejsca umo¿liwiaj¹ce klonowanie (MCS mul-

tiple cloning site), zwiêkszono liczbê kopii plazmidów

w komórce oraz skonstruowano wektory wielofunk-

cyjne, s³u¿¹ce do szczegó³owej analizy genów [21].

Wektor pUC.

Przyk³adami takich ulepszonych plaz-

midów s¹ plazmidy pUC18 i pUC19. Wektory te ró¿-

ni¹ siê od siebie jedynie odwrotn¹ orientacj¹ poli-

linkera w genie

lacZ

[24]. Zosta³y one skonstruowane

na Uniwersytecie w Kalifornii przez naukowców

M e s s i n g a i V i e i r a. Przy ich konstrukcji opar-

to siê o plazmid pBR322 i maj¹ one 40% wspólnego

z nim DNA. S¹ to ma³e plazmidy o wielkoci 2686 pz,

nios¹ce gen opornoci na ampicylinê oraz N-koñcowy

fragment genu

lacZ.

Miejsce inicjacji replikacji w plaz-

midach pUC pochodzi, tak jak w przypadku plazmidu

pBR322, z plazmidu pMB1 (rep pMB1). W plazmidach

pUC obecna jest jednak pojedyncza mutacja punkto-

wa w miejscu inicjacji replikacji oraz brak jest genu

rop.

To powoduje, ¿e plazmidy pUC wystêpuj¹ w wiêk-

szej liczbie kopii na komórkê (do 500 kopii) ni¿ plaz-

mid pBR322. Ich zalet¹ w stosunku do pBR322 jest

równie¿ to, ¿e zawieraj¹ polilinker, w którym znajduj¹

siê sekwencje rozpoznawane przez wiele enzymów re-

strykcyjnych [20]. Kolejn¹ zalet¹ tych plazmidów jest

prostszy sposób selekcji komórek zawieraj¹cych zre-

kombinowane DNA. Kolonie komórek zawieraj¹cych

plazmid pUC z dodatkowo wstawionym DNA bêd¹

mia³y bowiem inny kolor, od tych które zawieraj¹

sam, niezmieniony plazmid pUC (selekcja na bia³o-

niebieskie kolonie). Bezporednia selekcja pozytyw-

nych rekombinantów jest mo¿liwa dziêki zjawisku

-komplementacji.

W tego typu dowiadczeniach sto-

suje siê szczepy bakteryjne, posiadaj¹ce pojedyncz¹

delecjê w genie

lacZ

(mutacja we fragmencie

lacZ)

kodowanym na chromosomie bakteryjnym. Takie

szczepy (np. DH5a) produkuj¹ jedynie defektywn¹

formê enzymu

-galaktozydazy.

Stosuj¹c plazmidy

zawieraj¹ce fragment tego genu (lacZ) nastêpuje

komplementacja mutacji na chromosomie, powstaje

aktywna forma

-galaktozydazy

z podjednostki LacZ5

kodowanej na chromosomie oraz LacZ kodowanej na

plazmidzie. Aby zaobserwowanie tego zjawiska by³o

mo¿liwe, komórki wysiewa siê na pod³o¿e zawieraj¹ce

induktor IPTG (izopropylo--tiogalaktopiranozyd)

umo¿liwiaj¹cy transkrypcjê genu

lacZ,

oraz chromo-

genny substrat dla

-galaktozydazy

zwi¹zek X-Gal

(5-bromo-4-chloro-3-indolylo--D-galaktopiranozyd).

Kolonie komórek zawieraj¹ce plazmid z nieprzerwanym

Rys. 2. Mapa plazmidu pBR322

Zaznaczono: rep replikon pozwalaj¹cy na replikacjê plamidu (z plaz-

midu pMB1),

rop

fragment koduj¹cy bia³ko Rop,

amp

gen

-lakta-

mazy nios¹cy opornoæ na ampicylinê,

tet

gen opornoci na tetracyklinê.

ZASTOSOWANIE WEKTORÓW BAKTERYJNYCH W BIOLOGII MOLEKULARNEJ I W MEDYCYNIE

Rys. 3. Mapa plazmidu pDrive firmy Qiagen

Zaznaczono geny: kan opornoci na kanamycynê, amp gen

lacZ

nios¹cy opornoæ na ampicylinê, miejsce inicjacji replikacji oraz promo-

tory T7 i SP6. Na rysunku zaznaczono równie¿ miejsce do klonowania,

które jest przerwane, a jego sekwencja na koñcu 3 zawiera uracyl (U),

co pozwala na bezporednie u¿ycie produktów reakcji PCR (reakcja

PCR z polimeraz¹ Taq) do ligacji z wektorem.

warunek jest polimeraza Taq, wyizolowana z bakterii

Thermus aquaticus

[29]. Nie mo¿na stosowaæ natomiast

polimeraz takich jak np. polimeraza Pfu z

Pyrococcus

furiosus,

która nie dodaje dodatkowej adenozyny.

Wektor pDrive ma formê liniow¹ i na jego koñcach

wystêpuje uracyl komplementarny do adenozyny znaj-

duj¹cej siê na zewnêtrznych fragmentach produktów

po reakcji PCR z wykorzystaniem polimerazy Taq.

Konstrukcja wektora znacznie upraszcza procedurê

klonowania, poniewa¿ wektor pDrive jest ju¿ przy-

gotowany do bezporedniego zastosowania w reakcji

ligacji z produktem reakcji PCR. Wektor pDrive nie-

sie gen opornoci na kanamycynê i ampicylinê. Prost¹

selekcjê umo¿liwia gen

lacZ

(selekcja na bia³o-nie-

bieskie kolonie) [57].

Wektory pGEM T i pGEM T easy.

Wektory pGEM T

(rys. 4) i pGEM T easy s¹ wektorami o zastosowaniu

podobnym do zastosowania wektorów pDrive. S¹ rów-

nie¿ narzêdziami u³atwiaj¹cymi pracê przy klonowa-

niu produktów reakcji PCR. Oba wektory wystêpuj¹

w formie zlinearyzowanej, a na swoich koñcach maj¹

do³¹czon¹ tyminê, która poprawia wydajnoæ ligacji

produktu PCR z wektorem.

W ten sposób zapobiega siê recyrkulizacji wektora

i zapewnia kompatybilne sekwencje dla produktu PCR

namno¿onego odpowiednimi, termostabilnymi poli-

merazami, które na koñcach 3 produktu PCR dodaj¹

pojedyncz¹ adeninê. Wektory te wystêpuj¹ w komórce

w du¿ej liczbie kopii [56].

Wektory TOPO.

Kolejnym wektorem u³atwiaj¹cym

pracê w laboratorium jest miêdzy innymi wektor za-

wieraj¹cy enzym topoizomerazê I (produkowany jest

fragmentem genu

lacZ

(lacZ) s¹ zdolne do komple-

mentacji i wytwarzaj¹

-galaktozydazê,

która powo-

duje rozszczepienie X-gal, przez co na pod³o¿u selek-

cyjnym komórki bêd¹ zabarwione na niebiesko. Wsta-

wienie fragmentu DNA w miejsce MCS powoduje

przerwanie genu

lacZ,

komórki na pod³o¿u selek-

cyjnym bêd¹ wówczas bia³e, poniewa¿ nie powstanie

funkcjonalna

-galaktozydaza.

Natomiast gen opor-

noci na ampicylinê jest markerem pozwalaj¹cym na

³atw¹ selekcjê bakterii zawieraj¹cych zarówno plazmid

zrekombinowany jak i niezrekombinowany [24, 32].

2.1.2. Wektory komercyjne, nowe strategie

Obecnie wektory do klonowania czêsto tworzone

s¹ w laboratoriach ró¿nych firm komercyjnych. S¹ to

wektory skonstruowane tak by w maksymalnym stop-

niu u³atwiæ i przyspieszyæ pracê w laboratorium, s¹

tworzone do konkretnych zastosowañ, jak na przyk³ad

wektory do szybkiego klonowania produktów reakcji

PCR. Przyk³adami takich wektorów analizowanymi

w pracy s¹ wektory pDrive, pGEM T i pGEM T easy

oraz wektory z topoizomeraz¹.

Wektor pDrive.

Wektor pDrive (rys. 3) pozwala na

szybkie wykorzystanie produktów reakcji PCR. Fakt,

¿e na koñcach niektórych produktów reakcji PCR pozo-

stawiona jest adenozyna, pozwoli³ na skonstruowanie

wektora, który z wysok¹ specyficznoci¹ hybrydyzuje

z produktami PCR. Do reakcji PCR konieczne jest

wówczas zastosowanie odpowiedniej polimerazy, która

na koñcach nowosyntetyzowanych nici do³¹cz¹ dodat-

kow¹ zasadê adenozynê. Polimeraz¹, która spe³nia ten

Rys. 4. Mapa wektora pGEM T firmy Promega

Zaznaczono geny:

amp

opornoci na ampicylinê, origin replikacji,

lacZ

oraz promotory T7 i SP6. Zaznaczono równie¿ miejsce do klonowania,

które jest przerwane, a jego sekwencja na koñcu 3 zawiera tymidynê

(T), co pozwala na szybk¹ ligacjê odpowiednich produktów po reakcji

PCR z wektorem.

MA£GORZATA JOANNA STAWORZYÑSKA, RADOS£AW STACHOWIAK, JACEK BIELECKI

Rys. 5. Zastosowanie wektora TOPO TA w procesie klonowania

Wektor TOPO TA jest zlinearyzowany, a na obu koñcach do reszty 3 fosforanowej (oznaczenie P na rysunku) ma do³¹czon¹ topoizomerazê I (TOPO).

Topoizomeraza I rozpoznaje specyficzn¹ sekwencjê DNA (miejsca oznaczone *) i pozwala na po³¹czenie wektora TOPO TA z produktem PCR

o lepkich koñcach (A na rysunku oznacza dodatkow¹ adenozynê), amplifikowanym polimeraz¹ Taq. Po ligacji topoizomeraza I uwalnia DNA,

a wektor TOPO TA zawiera wstawiony produkt PCR.

przez firmê Invitrogen pod nazw¹ TOPO vector).

Wektor ten jest zlinearyzowany, a na obu koñcach do

reszty 3 fosforanowej ma do³¹czon¹ wi¹zaniem ko-

walencyjnym topoizomerazê I. Biologiczn¹ funkcj¹

topoizomerazy I jest nacinanie oraz ponowne ³¹czenie

DNA podczas procesu replikacji. Topoizomeraza I

wykorzystywana w TOPO wektorach pochodzi z wi-

rusa ospy krowiej vaccina virus. Enzym ten rozpozna-

je sekwencjê 5 (C/T)CCTT 3 i tworzy wi¹zanie ko-

walencyjne z grupami fosforanowymi do³¹czonymi do

3 tyminy. Nacina jedn¹ z nici DNA, pozwalaj¹c na

rozwiniêcie DNA. Nastêpnie enzym religuje koñce

rozciêtych nici i uwalnia DNA. Forma liniowa wekto-

rów TOPO pozwala na proste przeprowadzenie ligacji

wektora z kompatybilnymi koñcami produktu PCR.

Produkt PCR mo¿e byæ amplifikowany zarówno

z u¿yciem polimerazy Taq (rys. 5), zostawiaj¹cej lep-

kie koñce (dodatkowa adenozyna), jak i polimeraz zo-

stawiaj¹cych têpe koñce (rys. 6).

Ligacja nastêpuje w zaledwie po 5 minutach, w tem-

peraturze pokojowej [53].

Wektory BAC.

Wektory zwane BAC (bacterial arti-

ficial chromosomes) czyli sztuczne chromosomy bak-

teryjne s¹ bakteryjnymi systemami do klonowania,

których g³ówn¹ zalet¹ jest mo¿liwoæ klonowania na

nich du¿ych fragmentów obcego DNA (do 300 kpz).

Znakomicie nadaj¹ siê do tworzenia bibliotek genomo-

wych, pozwalaj¹ na zawarcie ca³ego genomu danego

organizmu w stosunkowo niewielkiej liczbie klonów.

Skonstruowane s¹ one na bazie wektora plazmidowego

F wystêpuj¹cego powszechnie u

E. coli.

Czynnik F

E. coli

determinuje p³eæ bakterii, jest plazmidem

o wielkoci oko³o 100 kpz, który koduje ponad 60 bia-

³ek [48]. Wektor BAC ma wielkoæ 7,5 kpz i z genów,

które wystêpowa³y pierwotnie na wyjciowym plaz-

midzie, zawiera miêdzy innymi geny

parA

parB

odpowiedzialne za replikacjê. Replikacja czynnika F

podlega cis³ej kontroli systemów reguluj¹cych

E. coli

i w wektorze BAC zapewnia to utrzymywanie jego

niskiej liczby kopii. To pozwala na stabilne utrzy-

mywanie du¿ych insertów DNA oraz obni¿a ryzyko

rekombinacji miêdzy fragmentami DNA niesionymi

przez wektor. Geny

parA

parB

s¹ odpowiedzialne

za prawid³ow¹ segregacjê plazmidów do komórek

potomnych. Uniemo¿liwiaj¹ one wspó³wystêpowa-

nie systemów BAC w pojedynczej komórce, co jest

zalet¹ w porównaniu do wektorów dro¿d¿owych YAC

(yeast artificial chromosome; sztuczne chromosomy

dro¿d¿owe) [40].

Rys. 6. Zastosowanie wektora Zero Blunt TOPO w procesie klonowania

Wektor Zero Blunt TOPO jest zlinearyzowany, a na obu koñcach do reszty 3 fosforanowej (oznaczenie P na rysunku) ma do³¹czon¹ topoizomerazê

I (TOPO). Topoizomeraza I rozpoznaje specyficzn¹ sekwencjê DNA (miejsca oznaczone *) i pozwala na po³¹czenie wektora Zero Blunt TOPO

z produktem PCR o têpych koñcach. Po ligacji topoizomeraza I uwalnia DNA, a wektor Zero Blunt TOPO zawiera wstawiony produkt PCR.

Plik z chomika:

Petroc

Inne pliki z tego folderu:

Harvey Lodish - Molecular Cell Biology.pdf (25627 KB)
PCR - THE BASICS, second edition.pdf (2287 KB)
2012-02-06 13.07.03.jpg (1328 KB)
2012-02-06 13.14.41.jpg (1133 KB)
2012-02-06 13.09.42.jpg (1118 KB)

wektory.pdf

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: