Rozpoznanie laboratoryjne, wykrywanie w produktach spożywczych bakterii z rodzaju Staphylococcus
· Ziarenkowce gram +
· Tworzą groniaste skupiska ( kiść winogron), w produktach żywnościowych najczęściej w postaci dwoinek
· Względne beztlenowce, ale preferują warunki tlenowe
· Szybki wzrost na podłożach wzbogaconych, możliwy wzrost na podłożach wybiórczo – namnażających
Podział gronkowców:
· A. koagulazo - dodatnie np. Sareus
· B. koagulazo –ujemne ( CNS – coagulazo- negativ Staphylococcus )
· Oporne na nowobiocynę np. S. Saprophytiasm S. sciuri )
Występują w powietrzu i glebie.
Skóra błony śluzowe ( S. aureus – nosicielstwo głównie nosogardziel )
Produkty żywnościowe
Mogą wywoływać infekcje
Najczęstsze źródła S. areus:
· Kremy, bita smietana, lody, budynie
· Mleko, sery, śmietana
· Sałatki ziemniaczano- jajeczne
· Konserwy rybne
· Gotowane mięso spożyte po dłuższym czasie od jego przygotowania.
Do zanieczyszczenia produktów spożywczych dochodzi przeważnie po obróbce termicznej na skutek bezpośredniego kontaktu z pracownikami – nosicielami S. aureus lub poprzez narzędzia. Źródłem zakażenia są osoby ze zmianami ropnymi na skórze z ostrymi nieżytami górnych dróg oddechowych. Innym źródłem jest surowiec spożywczy.
Zatrucia gronkowcem – intoksykacja
· Wywołane przez enterotoksyny gronkowcowe SE - wytwarza je ok. 50 – 70 % szczepów S. areus.
· 7 typów antygenowych enterotoksyny ( A, B, C1, C2, D,E,F )
Enterotoksyny
· Jednołańcuchowe polipeptydy tworzone w zakresie temp 10 – 45 stopni i pH >5
· Odpowiednie na działanie enzymów trawiennych ( nie ulegają inaktywacji w soku żołądkowym )
· Odporne na działania niskiej i wysokiej temperatury ( nie ulegają inaktywacji pod wpływem pasteryzacji i gotowania, pieczenia, rozkładowi ulegają w temp. 100 stopni po 30 min)
· Obecność w środkach spożywczych- sole peklujących nie zapobiegają rozwojowi S. areus i produkcji enterotoksyn.
· Najdogodniejsze warunki do produkcji enterotoksyn są wtedy gdy zanieczyszczony został gotowy produkt, który następnie przechowywano w > 10 stopni.
Zachorowanie- głównie w miesiącu letnim, czas inkubacji 2 – 6h
Objawy zatrucia
· Kurczowe bóle brzucha ( nadbrzusza)
· Gorączka
· Nudności, wymioty, biegunka ( krótkotrwała)
Choroba ustępuje samoistnie po 24 – 48 h po właściwym nawodnieniu.
Wykrywanie w żywności
I Namnażanie selektywne
W przypadku produktów o niskim poziomie zanieczyszczenia gronkowcami lub występowanie komórek uszkodzonych)
· Określa ilość badanej próby, wprowadzić do podłoża płynnego Giollitti i Cantoni
(zawiera NaCl, LiCl, mannitol, telluryn potasu. )
II Różnicowanie
Z probówki, w której nastąpiło zaczernienie podłoża lub wytworzył się na dnie szaroczarny osad, należy pobrać materiał i przesiać na podłoże stałe ( Baird- Parkera (B-P ) lub pożywkę (B-P z plazmą króliczą i fibrynogenem ( RFP) )
Podłoże Baird- Parkera z chlorkiem litorym i tellurynem potasu.
Drobne czarne lub szare kolonie otoczone ( kolonie typowe ) lub nie ( kolonie nietypowe) przezroczystą strefą.
III Potwierdzenie
· Posiew wybranych kolonii do bulionu mózgowo-sercowego
· Wykonanie probówkowego testu na obecność koagulazy ( dodane do hodowli bulionowej plazmy króliczej, wynik + to ścięcie i utworzenie skrzepu po 24 h inkubacji)
· Zastosowanie pożywki B-P z RFP umożliwia bezpośrednie wykrycie gronkowców koagulazo- dodatnich, które rosną w postaci: drobnych czarnych, szarych, lub białych kolonii otoczonych strefą zmętnienia.
Oznaczanie liczby
· Metoda płytkowa: posiew w 2 powtórzeniach zawiesiny wyjściowej badanej próbki lub jej 10-krotnych rozcieńczeń na podłoże B-P ( posiew powierzchniowy ) lub B-P z RFP ( posiew metodą zalewową)
· Inkubacja po – 24-48h
· Badania potwierdzające zdolność wytwarzania koagulazy ( dla kolonii p-B-P)
UWAGA!
Podłoże Chapmana
· Nie nadaje się np. do badania solanek i produktów solonych zawierających liczne bakterie holofilne, które rozwijają się na tym podłożu i mogą zakłócać wzrost gronkowców.
· Może okazać się zbyt mało selektywne również przy badaniu produktów zawierających liczną mikroflorę saprofityczną ( np. mięso mielone, befsztyk tatarski, niektóre sałatki )
Agar z krwią
· do posiewu produktów niezbyt silnie zakażonych różnorodną mikroflorą mieszaną
· Wzrost innych drobnoustrojów może całkowicie zahamować wzrost gronkowców
S. areus – hemoliza beta i gama
S. Epidermidis – hemoliza gama
Inne metody potwierdzenia S. aureus
· Wytwarzanie koagulazy à (+) S. areus
Koagulacja związana ( CF- clumping factory) wykrywa testem szkiełkowym z użyciem osocza krwi ludzkiej lub króliczej.
· Koagulacja wolna
Wykrywa w teście probówkowym.
· Beztlenowa fermentacja mannitolu( Hugh- Leifsona z mannitolem) + areus.
· Wytwarzania fosfotazy- + dla areus ale także niektóre S. epidermidis.
W produktach żywnościowych często obok gronkowców są Micrococcus spp. Dobrze rosnących na podłożach o zwiększonej zawartości NaCl i są morfologicznie podobne do gronkowców.
Testy różnicujące gronkowce od mikrokoków
· Tolerancja tlenu- posiew na podłoża tlenowe i beztlenowe à mikrokoki wyłącznie tlenowe
· Oznaczanie wrażliwości na furazolidon à gronkowce wrażliwe, mikrokoki oporne.
· Oznaczanie oksydazy cytochromowej u drobnoustrojów bezltenowych, mikrokoki
· Wrażliwość na lizostafine i lizozym à + Staphylococcus
Sposoby kontrolowania zagrożenia
· Właściwa higiena
· Temperatura odpowiednia obróbki termicznej
· Personel okresowo poddanych badaniom
· Przechowywanie surowców i produktów w warunkach uniemożliwiających produkcje toksyn
Charakterystyka podłoża Chapmana
Wybiórczo- różnicujące, w którym czynnikiem wybiórczym jest 7,5 % NaCl, różnicującym mannitol, podłoże służące do izolacji gronkowców, które można różnicować na podłożu ,mannitolo dodatnim czyli rozkład mannitolu i mannitolu ujemnego, rozkład mannitolu widoczny jest w postaci żółtego zabarwienia podłoża i żółtych kolonii, + S.areus, pozostałe nie zmieniają zabarwienia podłoża bo są mannitolo ujemne.
oliwc12