Klasyfikacja hodowli in vitro ze względu na rodzaj hodowanego materiału.docx

Klasyfikacja hodowli in vitro ze względu na rodzaj hodowanego materiału

Hodowle narządów:

·         Utrzymywanie sferycznego lub trójwymiarowego kształtu

·         Utrzymanie specyficznych interakcji histologicznych

Hodowle eksplantów:

·         Fragmenty tkanek

·         Po przyczepieniu następuje migracja komórek na powierzchnię naczynia

Hodowle komórkowe – hodowla rozdzielonych komórek:

·         Przyczepione komórki jako monolayer

·         Zawiesina komórek w pożywce

Klasyfikacja hodowli komórek in vitro ze względu na pochodzenie komórek i czas trwania:

·         Hodowle pierwotne (pierwszorzędowe)

·         Linie komórkowe:

1.       Pierwotne linie komórkowe

2.       Ustalone linie komórkowe

3.       Transformowane linie komórkowe (unieśmiertelnione)

Hodowle pierwotne

Pochodzą bezpośrednio z tkanki lub narządu i są hodowane jako:

·         Komórki migrujące w hodowli eksplantów

·         Komórki wyizolowane przez dyspersję i wprowadzone do hodowli jako zawiesina (inoculum)

Zalety:

Zachowują wiele cech komórek zróżnicowanych podobnie jak in vivo, ale mogą zmieniać się w warunkach in vitro

Schemat powstawania hodowli pierwotnej

Narząd à fragmenty tkanki lub narządu à

Wady hodowli pierwotnej:

·         Często wymagają uśmiercenia zwierzęcia

·         Procedura zakładania hodowli pierwotnej jest zwykle czasochłonna i żmudna

·         Mogą być utrzymywane w hodowli tylko przez określony i zwykle krótki czas

·         Muszą być zakładane dla każdego eksperymentu

·         Stanowią heterogenną populację komórek

·         Ponieważ zwykle są heterogenne, stopniowo dochodzi do przerostu wszędobylskimi fibroblastami

Schemat powstawania hodowli narządów lub eksplantów

Narząd à kawałeczki tkanki lub cały narządà izolacja/pocięcie tkanki lub narząduà??

Charakterystyka hodowli pierwotnej eksplantów

·         Fragment tkanki zanurzony w odpowiednio napowietrzonej tkanki

·         Utrzymywana jest trójwymiarowa struktura (3D) oraz interakcje międzykomórkowe

·         Ograniczenie stanowi rozmiar pozwalający na dyfuzję gazów i składników odżywczych (zwykle ok. 1 mm3)

·         Ograniczona ilość eksperymentów

·         Powolny i ograniczony jest rozrost tkanek

·         Hodowla może być wykorzystywana do wyprowadzenia hodowli komórek

Rys 2

Izolacja komórek

Polega na oddzieleniu komórek od macierzy międzykomórkowej i uzyskaniu zawiesiny pojedynczych komórek

Metody izolacji i rozdzielania komórek

·         Mechaniczna (skrobanie, przecieranie przez sitka)

·         Enzymatyczna – trawienie enzymami proteolitycznymi (kolagenaza, trypsyna)

·         Wirowanie w gradiencie (np. surowicy, perkolu, fikolu)

·         Sortery (np. cytofluorymetr przepływowy)

Izolacja mechaniczna + enzymatyczna komórek z tkanek z dużą ilością włókien kolagenowych

Rys 3

Rozdział komórek przez wirowanie

·         W gradiencie prędkoci – frakcje wędrują w zależności od ciężaru – im mniejsza frakcja tym większej prędkości trzeba użyć

·         W gradiencie gęstości – frakcje wedrują w zależności od rozmiaru i kształtu, gdy użyje się niskiego gradientu cukru (5 – 20%); w zależności od gęstości frakcji, gdy użyje się wysokiego gradientu cukru (20 – 70%)

Liczenie komórek

·         Hemacytometry np. komora Bürkera

·         Automatyczne liczniki komórek

Określenie żywotności komórek

Stosowane barwniki:

·         Błękit trypanu – komórki martwe – niebieskie jądra

·         Bromek etydyny – komórki martwe – jądra czerwone

·         Jodek propydyny – komórki martwe – jądra czerwone

·         Dwuoctan fluoresceiny – komórki żywe – zielona fluorescencja cytoplazmy

Obliczanie ilości komórek./ml

Całkowita liczba policzonych komórek x (rozcieńczenie) x (10,000)

liczba kwadratów

Np. jeśli policzyliśmy np. 62 komórki, rozcieńczenie wynosiło 1 : 1, a ilość policzonych kwadratów np. 10 to:

62/10 x 2 x 104 = 1.24x105 czyli 124 000 komórek na 1 ml

Oznaczenie @ żywotności komórek

Ilość komórek żywych x 100%

Całkowita ilość komórek

Np. 54/62 x 100 = 87.09%

Zawiesina:

·         Komórki rosną pływając w pożywce

·         Mogą proliferować w zawiesinie (niezależnie od przyczepienia)

Monolayer (metoda 1 warstwy)

·         Komórki przyczepione do podłoża migrują/proliferują

·         Są zależne od przyczepienia

·         Sposób wzrostu charakterystyczny dla większości komórek

Adhezja komórek

·         Odbywa się dzięki obecnym na ich powierzchni receptorom dla cząsteczek matrix pozakomórkowego

·         Rozpłaszczenie komórek zaczyna się w momencie, kiedy wydzielą one specjalne białka i proteoglikany, tworzące matrix np.fibronektynę, lamininę, kolagen

·         Substancje te wiążą się z podłożem, a dopiero do nich wiążą komórki

·         W wiązaniu komórek z podłożem biorą również udział białka pochodzące z surowicy dodawanej do medium

Identyfikacja komórek

Komórki identyfikuje się biorąc pod uwagę:

·         Kariotyp

·         Antygeny powierzchniowe – immunohistochemiczne

·         Elementy cytoszkieletu – immunohistochemia, immunofluorescencja

·         Markery – PCR, western

Zalety i wady hodowli komórek rosnących w systemie dwuwymiarowym (2D)

Zalety:

·         Łatwe w stosowaniu przez relatywnie długi czas

·         Wystandaryzowane protokoły hodowli

Wady:

·         Nie są reprezentatywne dla warunków in vivo

Hodowle w zawiesinie i hodowle trójwymiarowe