ĆWICZENIA 2: REAKCJE CHARAKTERYSTYCZNE CUKRÓW
1. PRÓBA MOLISCHA z α-naftolem /5.1.3.1./
Zasada metody
Dodatnią próbę Molischa wykazują wszystkie cukry, a także aldehydy, aceton i kwasy organiczne. W obecności stężonego kwasu siarkowego dochodzi do odwodnienia cukrów i powstaje furfural lub 5-hydroksymetylofurfural, które z α-naftolem tworzą kompleksy. Ujemna próba Molischa wyklucza obecność cukru.
Postępowanie:
2. Do 2 ml badanego roztworu dodać dwie krople odczynnika Molischa zawierającego α-naftol, zmieszać i ostrożnie podwarstwić 1 ml stęzonego kwasu siarkowego.
3. Na granicy faz powstaje czerwono-fioletowy krążek.
Materiały i odczynniki:
4. 1% roztwór glukozy, fruktozy, sacharozy
5. 0,1% roztwór skrobi i glikogenu
6. odczynnik Molischa: 10% α-naftol
7. stężony kwas siarkowy (VI)
Podsumowanie:
8. zaszła reakcja z sacharozą - reakcja pozytywna
9. cukier zostaje odwodniony przez H2SO4, który po reakcji z alfa-naftolem tworzy pierścień (na granicy faz)
10. PRÓBA SELIWANOWA /5.1.4./
Dodatni odczyn seliwanowa wykazują ketozy. Po odwodnieniu tych cukrów w obecności stężonego kwasu solnego powstaje furfural lub 5-hydroksymetylofurfural, które z rezorcyną tworzą barwne kompleksy. Barwa pomarańczowo- różowa- oznacza, że mamy ketozy
11. Do 1 ml odczynnika Seliwanowa dodać kroplę roztworu fruktozy. Zmieszać i wstawić do wrzącej łaźni wodnej dokładnie na 30 sek.
12. Wyjąć i oziębić. Próba przyjmuje czerwone zabarwienie.
13. Próbę powtórzyć na innych cukrach. Inne cukry dają dodatni odczyn Seliwanowa po dłuższym ogrzewaniu.
14. 1% roztwór glukozy, fruktozy i sacharozy
15. 0,1% roztwór skrobi, glikogenu
16. odczynnik Seliwanowa: stężony kwas solny rozcieńczyc dwa razy wodą i rozpuścić w nim rezorcynę do uzyskania roztworu o stężeniu 0,05%
17. PRÓBA BENEDICTA /5.1.6.2./
Próba ta stanowi jeden z najczulszych odczynów redukcyjnych na cukry. Barwa powstającego osadu tlenku miedziawego zależy od wielkości cząsteczek wypadających z roztworu. Cząstki najdrobniejsze dają barwę zieloną, a największe czerwoną. Próba ta może służyć do przybliżonego określania stężenia cukru w badanym roztworze.
18. Do 5 rnl odczynnika Benedicta dodać 8 kropli badanego roztworu cukru, zmieszać i wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 5 min.
19. Po oziębieniu w strumieniu bieżącej wody, roztwót zmięnia barwę i mętnieje.
Tabela. Zależność odczynu Benedicta od zawartości cukru.
barwa
ocena redukcji
przybliżona zawartość cukru (g/100ml)
bez zmian
-
0
zielona, brak osadu
+/-
0,1-0,3
zielona, osad
+
0,5
żółto-zielona, osad
++
1,0
pomarańczowa, osad
+++
1,5
czerwona, osad
++++
2,0 i powyżej
20. 0,1, 0,5, 1,5% roztwory glukozy
21. odczynnik Benedicta: 173 g krystalicznego cytrynianu sodu i 100 g bezwodnego węglanu sodu rozpuścić na gorąco w 600 ml wody; przesączyć, a do przesączu dodawać wolno stale mieszająć, 100 ml 17,3% roztworu siarczanu (VI) miedzi (II); uzupełnić do 1 l wodą;
22. w reakcji wykrywane są polisacharydy, takie jak skrobia i glikogen, jedynie w środowisku kwaśnym
23. PRÓBA JODOWA /5.3.1./
Zasada metody:
Zabarwienie skrobi pod wpływem jodu spowodowane jest adsorpcją jodu na cząsteczce polisacharydu. Adsorpcja ma charakter kanałowy, tzn. cząsteczki jodu wchodzą do kanału utworzonego przez spiralnie skręcone łańcuchy skrobi. Cząsteczki jodu w obrębie spirali skrobi tworzą prosty łańcuch, wzdłuż którego mogą przemieszczać się elektrony, co powoduje pochłanianie światła przez cały kompleks. Barwa zależy od długości łańcucha. Amyloza daje zabarwienie niebieskie, amylopektyna fioletowo-czerwone. W obecności zasad zabarwienie nie powstaje, gdyż jod reaguje z jonem wodorotlenowym.
24. Do 2 ml słabo kwaśnego roztworu skrobi dodać 1 kroplę 0,01 M rożworu jodu w 1% jłodku potasu. Próbę powtórzyć na roztworze glikogenu.
25. Probówki, w których powstała niebieska barwa z jodem, ogrzać we wrzącej łaźni wodnej, a nastęnie oziębić pod bieżącą wodą.
26. Próbę powtórzyć używając zasadowęgo roztworu skrobi oraz skrobi, do której uprzednio dodano etanol.
Odczynniki:
27. 0,1% roztwór skrobi, glikogenu
28. 0,01 M jod w 1% jodku potasu
29. 2M chlorek sodu
30. 2M kwas solny
31. etanol
32. 1M wodorotlenek sodu
33. PRÓBA BARFOEDA /5.1.6.2./
Próba ta pozwala na odróznienie monosacharydów od disacharydów redukujących na podstawie reakcji redukcji w środowisku lekko kwaśnym. Monosacharydy łatwo wykazują właściwości redukujące (ok. 3 minuty) natomiast disacharydy (ok. 6 minut) dopiero po dłuższym ogrzewaniu, gdy zostanie rozerwane wiązanie glikozydowe.
34. Do 1 ml odczynnika Barfoeda dodać 1 ml roztworu cukru i po wymieszaniu wstawić do łaźni wodnej na 3 min.
35. Pojawia się czerwony osad tlęnku miedziawego (Cu2O) w probówce z monosacharydem, a w probówkach z disacharydami dopiero po ogrzewaniu kilkunastominutowym.
36. odczynnik Barfoeda: 13,3 g octanu miedzi rozpuścić w 200 ml wody, przesączyć i dodać 1,8 ml kwasu octowego lodowatego
37. pierwsza zostanie wykryta glukoza (zabarwienie różowe) - monosacharyd redukcyjny, następnie maltoza - disacharyd redukcyjny, natomiast sacharoza nie zostanie wykryta, bo jest polisacharydem
ĆWICZENIA 3: REAKCJE BARWNE AMINOKWASÓW I NIEKTÓRE WŁAŚCIWOŚCI BIAŁEK
38. REAKCJA KSANTOPROTEINOWA /2.5.1.1./
Stęźony kwas azotowy (V) wytrąca białka i nitruje pierścienie benzenowe aminokwasów aromatycznych. Produkty reakcji ksantoproteinowej (gr. santhos - żółty) dają barwę od jasnożóltej do brązowej, znacznie intensywniejszą po zalkalizowaniu próby. Najtrudniej reakcji nitrowani ulega fenyloalanina.
Postępowanie
39. Do 2 ml roztworu aminokwasu lub białka dodać kroplami (Ostrożnie!) ok,0,5 m| stężonego kwasu azotowego i jedną do dwoch kropli stężonego kwasu siarkowego.
40. Całość ogrzewać 30 sekund we wrzącej łaźni wodnej. Opisać uzyskane wyniki.
Materiały i odczynniki
41. 0,1% roztwory tyrozyny, fenyloalaniny, tryptofanu oraz 1% roztwór albuminy
42. stężony kwas azotowy (V)
43. stężony kwas siarkowy (VI)
44. REAKCJA Z NINHYDRYNĄ /2.6.1./ (Ogólny odczyn na aminokwasy)
Reakcja z ninhydryną służy do jakościowego i ilościowego oznaczania wolnych aminokwasów. Podczas ogrzewania ogrzewania z ninhydryną w pH 5-5.5 aminokwasy ulegają tlenowej dezaminacji i dekarboksylacji. W czasie tej reakcji ninhydryna redukuje się i łączy się z amoniakiem (powstałym z rozkładu aminokwasu) oraz druga cząsteczka ninhydryny - tworząc kompleks o zabarwieniu fioletowo-niebieskim z max. absorbcji przy 570nm . Prolina posiadająca grupę iminową w miejscu grupy alfa-aminowej, tworzy z ninhydryną innego typu kompleksy o zółtym zabarwieniu z maksimum absorpcji przy 440 nm . Cysteinę i cystynę można oznaczyć tą metodą dopiero po przeprowadzaniu ich w kwas cysteinowy.
Odczyn barwny z ninhydryną dają również peptydy posiadające większą ilość wolnych grup aminowych i karboksylowych, a takżę aminy, sole amonowe, aminocukry i amoniak. Z uwagi na czułość reakcji, z pracowni, w której oznacza się aminokwasy tą metodą, należy usunąć wszystkie odczynniki zawieraiące amoniak.
Postępowanie :
45. Do 3 probówek odpipetować kolejno po 1 ml: wody, 0,1% albuminy, 1% roztworu glicyny.
46. Zawartość probówek zakwasić do pH 5,0-5,5 dodając kroplami roztwór kwasy octowego. Po dodaniu każdej kropli sprawdzić pH roztwory papierkiem uniwersalnym.
47. Do wszystkich probówek dodać po 0,5 ml roztworu ninhydryny, wymieszać i ogrzać do wrzenia w płomieniu palnika gazowego lub we wrzącej łaźni wodnej.
48. Uzyskane wyniki zamieścić w tabelki wyników, wyrażając intensywność zabarwienia symbolami:*** barwa bardzo intensywna** barwa średnio intensywna* lekkie zabarwienie- brak zabarwienia
roztwór
...
biologia_uwr