MATERIAŁY POMOCNICZE I ĆWICZENIA LABORATORYJNE
Z TECHNOLOGII PREPARATÓW ENZYMATYCZNYCH POCHODZENIA MIKROBIOLOGICZNEGO
Praca zbiorowa pod redakcją
Gdańsk 2007
6. OTRZYMYWANIE I ZASTOSOWANIA IMMOBILIZOWANYCH ENZYMÓW
6.1. Rodzaje i charakterystyka preparatów
Enzymy rozpuszczone w środowisku reakcji mogą być stosowane tylko w procesach przebiegających okresowo. Po ich zakończeniu konieczna jest zazwyczaj inaktywacja biokatalizatora, którego pozostałość zanieczyszcza produkt. Rozwiązaniem problemu jest stosowanie unieruchomionych (immobilizowanych) enzymów, których użycie obniża koszt i usprawnia wytwarzanie wielu produktów poprzez zapewnienie ciągłości procesu oraz długotrwałe wykorzystanie tej samej porcji preparatu w kolejnych szarżach produkcyjnych lub w reaktorach przepływowych. Stosowanie unieruchomionych enzymów jest także korzystne ze względu na lepszą kontrolę warunków reakcji oraz brak zanieczyszczenia produktu enzymem i innymi substancjami pochodzącymi z mało oczyszczonego preparatu biokatalizatora. W przypadku enzymów proteolitycznych immobilizacja zapobiega ich autodestrukcji.
Immobilizowanymi enzymami są nie tylko preparaty wytworzone przez połączenie biokatalizatora z nośnikiem nierozpuszczalnym w środowisku reakcji, a także nierozpuszczalne agregaty cząsteczek lub kryształów białka oraz enzymy zamknięte w strukturze żelu lub oddzielone od środowiska reakcji półprzepuszczalnymi membranami (Rys.5). Stosowanie immobilizowanych enzymów ogranicza się jednak do katalizowania konwersji substratów występujących w stanie ciekłym lub w formie roztworów bo tylko w tym przypadku możliwe jest łatwe oddzielenie biokatalizatora po zakończeniu procesu.
W celu unieruchomienia enzymu można wykorzystać różnego rodzaju oddziaływania cząsteczek enzymu z matrycą odpowiednio dobranego nośnika. Ubocznym efektem tego procesu jest stabilizacja struktury biokatalizatora przeciwdziałająca niekorzystnemu wpływowi środowiska. Przejawia się to wzrostem odporności preparatu na działanie podwyższonej temperatury, rozpuszczalników organicznych i substancji denaturujących. Innym pozytywnym skutkiem immobilizacji enzymów jest obniżenie inhibicji produktami reakcji oraz zmiana specyficzności względem inhibitorów, spowodowana przekształceniami trzeciorzędowej struktury centrum katalitycznego. Związanie z nośnikiem utrudnia jednak oscylacyjne zmiany cząsteczek biokatalizatora podczas reakcji oraz ogranicza w pewnym stopniu dostępność substratu do cząsteczek enzymu. Następstwem tego jest obniżenie aktywności preparatu, zależne między innymi od rodzaju nośnika, jego porowatości oraz od odległości cząsteczek enzymu od powierzchni nośnika. W przypadku nośników porowatych na aktywność katalityczną immobilizowanego enzymu wpływają w dużym stopniu opory dyfuzyjne przepływu substratów i produktów reakcji.
Negatywne efekty immobilizacji przejawiają się zwykle obniżeniem powinowactwa enzymu do substratu (zwiększenie stałej Michaelisa oraz zmniejszenie Vmax).
Podczas długotrwałego stosowania preparatu immobilizowanego enzymu następuje stopniowe zmniejszanie jego aktywności katalitycznej spowodowane częściową desorpcją biokatalizatora lub jego inaktywacją pod wpływem podwyższonej temperatury reakcji lub nieodpowiedniej kwasowości i siły jonowej środowiska. Innymi przyczynami tego zjawiska mogą być: blokowanie enzymu cząsteczkami produktu, adsorpcja zanieczyszczeń działających jako inhibitory lub też rozwój drobnoustrojów.
Stosowanie nośników o charakterze kationitów lub anionitów powoduje pozorną zmianę optymalnego pH działania enzymu. Ładunek powierzchniowy matrycy jest przyczyną gradientu protonów w warstwie granicznej enzym/nośnik. Wskutek tego wartości wyznaczone podczas pomiaru optymalnego pH reakcji nie odzwierciedlają rzeczywistego stężenia H+ w okolicy cząsteczek enzymu. Oddziaływania elektrostatyczne z powierzchnią nośnika są też jedną z przyczyn zmniejszenia powinowactwa enzymu do posiadających ładunek elektryczny cząsteczek substratu.
6.2. Sposoby immobilizacji
Najwcześniejsze sposoby immobilizacji polegały na przyłączeniu enzymu do powierzchni nośnika. Odbywa się to przez fizyczną adsorpcję biokatalizatora, wiązanie z udziałem oddziaływań jonowych lub przez wytworzenie wiązań kowalencyjnych. Jeśli bezpośrednia reakcja pomiędzy białkiem a nośnikiem nie jest możliwa stosuje się substancje posiadające co najmniej dwie grupy chemiczne zdolne do reakcji zarówno z nośnikiem jak i enzymem. Zwiększają one odległość pomiędzy cząsteczkami unieruchomionego enzymu a powierzchnią nośnika, co ułatwia dostęp substratu do centrum katalitycznego.
W przypadku gdy nie ma potrzeby zbyt trwałego wiązania enzymu jako nośniki stosuje się rozmaite sorbenty, których zaletą jest nieskomplikowana procedura immobilizacji oraz możliwość łatwej regeneracji poprzez wymycie nieaktywnego już białka. Nie następują też zazwyczaj zmiany struktury cząsteczek enzymu, które mogą spowodować zmniejszenie jego aktywności. Niewielka energia uczestniczących w wiązaniu białka oddziaływań jest jednak przyczyną dość szybkiej desorpcji enzymu podczas działania reaktora.
Silniejszą immobilizację zapewniają oddziaływania jonowe występujące w zakresie pH przy którym zarówno enzym jak i nośnik uzyskują ładunek elektryczny. Jeśli grupy funkcyjne enzymu i nośnika mają ładunek jednakowego znaku do zaistnienia wiązania niezbędne są dwuwartościowe kationy, sprzęgające białko za pośrednictwem mostków solnych. W przypadku stosowania silnych kationitów lub anionitów poszerza to zakres wartości pH przy których następuje jonowe wiązanie enzymu. Przykładem tego są nośniki z grupami sulfonowymi, które angażują kationy Me2+ w wiązanie –OSO3-+Me+-OOC- zastępujące bezpośrednie oddziaływanie grup –OSO3- i +H3N- wyeliminowane wskutek zaniku protonowania grup aminowych enzymu.
W celu ograniczenia desorpcji enzymów w środowisku o podwyższonej sile jonowej stosuje się nośniki o dużej gęstości i dostępności ładunku. Wytwarza się je przez pokrycie sorbentu warstwą polietylenoiminy, chitozanu lub innego polimeru. Zwiększenie energii wiązania i poprawa stabilności preparatu jest skutkiem wielopunktowego oddziaływania enzymu z nośnikiem uzależnionego od gęstości ładunku oraz od wielkości i struktury cząsteczek białka. Immobilizację bez udziału wiązań kowalencyjnych z powodzeniem stosowano do unieruchamiania lipaz i innych enzymów katalizujących reakcje w środowisku zawierającym rozpuszczalniki organiczne.
Zmniejszenia aktywności operacyjnej preparatu spowodowanego desorpcją enzymu można uniknąć wykorzystując procedury immobilizacji polegające na wytwarzaniu wiązań kowalencyjnych w warunkach nie powodujących denaturacji białka. Niepożądanemu sprzęganiu enzymu za pośrednictwem reszt aminokwasowych centrum katalitycznego można przeciwdziałać blokując je przed immobilizacją cząsteczkami substratu lub kompetytywnych inhibitorów, usuwanymi następnie po zakończeniu unieruchamiania. Kowalencyjne wiązanie enzymu odbywa się z udziałem białkowych reszt lizyny, argininy, cysteiny, tyrozyny, kwasów glutaminowego i asparaginowego oraz aminokwasów znajdujących się w pozycji N- lub C-terminalnej. Zależnie od budowy chemicznej nośnika przeprowadzane są reakcje alkilowania, arylowania diazowania amidowania oraz tworzenia wiązań amidowych lub zasad Schiff,a. Niekiedy stosuje się skojarzone metody immobilizacji polegające na tworzeniu odrębnych wiązań kowalencyjnych z grupami funkcyjnymi różnego rodzaju. Jako nośniki przydatne są między innymi polimery zawierające wolne grupy aminowe, umożliwiające sprzęganie białka enzymatycznego w łagodnych warunkach za pośrednictwem aldehydu glutarowego. Jego wadą jest tendencja do tworzenia oligomerów o zróżnicowanej długości cząsteczek, będąca przyczyną niejednakowego oddalenia poszczególnych cząsteczek biokatalizatora od powierzchni nośnika. Następuje wskutek tego zróżnicowanie aktywności preparatów wytwarzanych w odrębnych szarżach produkcyjnych zależne od pochodzenia, czystości i okresu przechowywania aldehydu.
Nośniki pozbawione grup chemicznych tworzących wiązania kowalencyjne z białkiem lub substancją sprzęgającą, jak np. szkło porowate, żel krzemionkowy, tlenki metali lub rozmaite substancje ceramiczne aktywuje się g-aminopropylotrietoksysilanem. Uzyskane pochodne zawierają grupy aminowe umożliwiające przyłączenie enzymu za pośrednictwem aldehydu glutarowego, tiofosgenu, chlorku p-nitrobenzoilu lub bezwodnika bursztynowego. Aktywację wymienionych nośników można także osiągnąć stosując BCl3 lub SiCl4 a w dalszym etapie alifatyczną diaminę. Negatywnym skutkiem kowalencyjnego wiązania enzymu jest zmniejszenie aktywności preparatu spowodowane zmianami struktury cząsteczek białka oraz ograniczeniem dostępu substratu do centrum katalitycznego.
Inne sposoby otrzymywania nierozpuszczalnych preparatów enzymów polegają na międzycząsteczkowym sieciowaniu biokatalizatora za pośrednictwem wiązań wytworzonych z substancjami dwufunkcyjnymi, takimi jak aldehyd glutarowy i inne polialdehydy lub kwas bis-diazobenzydynosulfonowy. W zależności od sposobu przygotowania białka i warunków sieciowania uzyskiwane są preparaty różniące się aktywnością, termostabilnością, odpornością na działanie substancji denaturujących białka, stopniem uwodnienia, wielkością ziaren i wytrzymałością mechaniczną.
Sieciowanie białek znajdujących się w roztworze prowadzi do znacznego uwodnienienia precypitatu oraz niewielkiej wytrzymałości mechanicznej i zróżnicowanej wielkości ziaren. Immobilizowany w ten sposób enzym charakteryzuje się wprawdzie polepszoną termostabilnością ale trudno jest wytworzyć preparaty o powtarzalnych właściwościach ze względu na duży wpływ niewielkich nawet zmian stężenia substancji sieciującej oraz pH, temperatury i siły jonowej środowiska reakcji. Niekorzystnym skutkiem sieciowania rozpuszczonych białek jest powolna precypitacja wytworzonych agregatów cząsteczek oraz znaczne, niekiedy nawet ponad 50 % zmniejszenie aktywności enzymu. Lepsze preparaty uzyskiwano natomiast podczas sieciowania kryształów białka lub też agregatów jego cząsteczek strąconych wskutek zmniejszenia solwatacji enzymu lub zmiany stałej dieelektrycznej roztworu.
Korzystne właściwości katalityczne przejawiają kryształy białka enzymatycznego agregowane zazwyczaj za pomocą aldehydu glutarowego. Uzyskane preparaty (Cross-Linked Enzyme Crystals, CLEC) składają się z prawie czystego białka i dzięki temu wykazują dużą aktywność i odporność na działanie czynników denaturujących, Wynika to z licznych oddziaływań elektrostatycznych i hydrofobowych występujących w kryształach. Krystaliczna struktura preparatu utrudnia jego inaktywację spowodowaną degradacją enzymu pod wpływem proteaz znajdujących się w niektórych przetwarzanych surowcach. Warunkiem rozpowszechnienia tej metody immobilizacji jest polepszenie sposobów wydajnego uzyskiwania kryształów białek o optymalnym kształcie i wielkości oraz dostępności przenikających ich strukturę kanałów, ułatwiających penetrację roztworu substratu. Wadą preparatów tego rodzaju są niewielkie rozmiary cząstek usieciowanych kryształów będące przyczyną zwiększenia oporów przepływu substratu w reaktorach kolumnowych.
Długotrwałej i trudnej niekiedy do przeprowadzenia krystalizacji enzymów można uniknąć sieciując precypitat strącony uprzednio w niedenaturujących warunkach roztworami soli, rozpuszczalnikami organicznymi, bądź polimerami niejonowymi. Korzystną cechą tak wytworzonych preparatów (Cross-Linked Enzyme Aggregates, CLEA) jest możliwość regulacji ich specyficzności poprzez wybór odpowiedniej substancji strącającej i warunków procesu. Wynika to z charakterystycznego i zróżnicowanego wpływu każdego sposobu strącania na strukturę białek w precypitacie, utrwaloną następnie wskutek sieciowania preparatu. Istnieje więc możliwość uzyskania z tego samego enzymu preparatów o różnym powinowactwie do substratów i odporności na działanie inhibitorów.
Do immobilizacji enzymów można też wykorzystać błony o selektywnej przepuszczalności, spełniające wyłącznie funkcję separacyjną, bądź też zarówno funkcję separacyjną jak i katalityczną. Aktywność unieruchomionych w ten sposób enzymów zależy głównie od szybkości dyfuzji substratu i produktu reakcji przez membranę. Nie zawierające enzymu membrany bierne służą do zamknięcia roztworu biokatalizatora w mikrokapsułce lub w module reaktora. Do mikrokapsułkowania konieczne jest stosowanie błon przepuszczających zarówno cząsteczki substratów jak i produktów reakcji. Membrany zatrzymujące tylko cząsteczki substratu są natomiast przydatne do oddzielenia produktów reakcji od zawierającej rozpuszczony enzym mieszaniny reakcyjnej (Rys.6).
Membrany aktywne katalitycznie, które zawierają enzym umiejscowiony w ich strukturze lub osadzony na powierzchni polimeru są używane do katalizowania reakcji wytwarzających produkty różniące się od substratów rozpuszczalnością w fazie rozpuszczalnika organicznego i wody.
Kolejną metodą unieruchamiania enzymów jest pułapkowanie (inkluzja) w strukturze żelu wytwarzanego po zmieszaniu roztworów enzymu i substancji żelującej. Mała energia oddziaływań wiążących enzym z tworzącym żel polimerem jest przyczyną łatwego wymywania biokatalizatora i dość szybkiego spadku aktywności preparatu. Przechodzenie biokatalizatora do mieszaniny reakcyjnej, może być ponad to przyczyną zmian właściwości wyrobu spowodowanych niecałkowitym zahamowaniem przebiegu reakcji. Można temu przeciwdziałać sieciując żel adehydem glutarowym lub innymi substancjami. Pułapkowanie w żelu nie nadaje się do immobilizacji hydrolaz powodujących degradację jego składników i nie powinno być stosowane w przypadku gdy substraty lub produkty reakcji z trudnością migrują w strukturze polimeru, np. z powodu zbyt dużej masy cząsteczkowej.
6.3. Stosowane nośniki
Podstawą dokonania wyboru nośnika i sposobu jego sprzęgania z enzymem powinny być warunki projektowanego procesu i przeznaczenie produktu. Unieruchomione enzymy stosowane do wytwarzania składników żywności nie powinny zanieczyszczać środowiska reakcji nawet śladową ilością substancji o niekorzystnym oddziaływaniu fizjologicznym. Aktywność, stabilność operacyjna i koszt preparatu immobilizowanego enzymu zależy w dużym stopniu od właściwości nośnika, które powinny być dostosowane do temperatury, kwasowości, lepkości i polarności środowiska reakcji oraz do konstrukcji używanego reaktora. Oceniając przydatność substancji jako nośnika należy uwzględnić jej powierzchnię właściwą, rozmiary ziaren i ich porowatość, wytrzymałość mechaniczną, ilość, dostępność i rodzaj grup funkcyjnych wiążących enzym oraz zawartość grup hydrofilowych i hydrofobowych.
Niekiedy konieczna jest modyfikacja powierzchni nośnika mająca na celu wprowadzenie grup funkcyjnych reagujących z białkiem lub zmianę jej polarności. Można ją przeprowadzić pokrywając nośnik warstwą reagującego z białkiem polimeru lub też wbudowując pożądane grupy chemiczne podczas syntezy nośnika. Do immobilizacji enzymów stosowanych w środowisku wodnym przydatne są polimery o właściwościach hydrofilowych. Przykładem zastosowania nośników z ugrupowaniami hydrofobowymi jest katalizowana lipazami produkcja rozmaitych emulgatorów, środków pianotwórczych, żelujących i surfaktantów przebiegająca z większą wydajnością w środowisku zawierającym apolarne rozpuszczalniki. Zaletą porowatych nośników jest duża powierzchnia kontaktu ze środowiskiem reakcji, umożliwiająca zwiększenie ilości przyłączonych cząsteczek enzymu. Niepożądanym skutkiem wzrostu porowatości jest jednak nasilenie oporów dyfuzyjnych, utrudniających transport substratów i produktów katalizowanego procesu przez warstwę graniczną enzym/środowisko reakcji.
Substancje używane do immobilizacji enzymów powinny się charakteryzować stabilnością w warunkach procesu, odpornością na degradację pod wpływem drobnoustrojów oraz gęstością właściwą i wytrzymałością mechaniczną dostosowaną do rodzaju reaktora. Kształt, gęstość i wielkość ziaren nośnika oraz ich odporność na ścieranie determinują skuteczność i czas oddzielania immobilizowanego enzymu od cieczy poreakcyjnej w reaktorach ze złożem fluidalnym. Nośniki przeznaczone do wykorzystania w reaktorach kolumnowych powinny natomiast wykazywać wytrzymałość mechaniczną nie dopuszczającą do ich rozkruszenia pod wpływem ciśnienia wywieranego przez strumień substratu. Nośnikami enzymów mogą być polimery syntetyczne lub naturalnego pochodzenia oraz wiele nieorganicznych adsorbentów, takich jak: szkło porowate, żel krzemionkowy, tlenki metali, glinokrzemiany oraz rozmaite substancje ceramiczne poddawane często modyfikacji mającej na celu wprowadzenie grup funkcyjnych wiążących białko (Rys.7).
Produkowane aktualnie nośniki są zazwyczaj nierozpuszczalne. Stosuje się jednak także polimery, których rozpuszczalność zależy od warunków środowiska. Wiązanie białka enzymatycznego z takimi substancjami daje możliwość katalizowania reakcji w fazie ciekłej, a następnie strącenia immobilizowanego biokatalizatora po zakończeniu procesu pod wpływem zmian temperatury, pH lub siły jonowej mieszaniny reakcyjnej. Szybkie przerwanie katalizowanego procesu zapewniają preparaty enzymów immobilizowanych na ferromagnetycznych nośnikach, usuwanych z cieczy poreakcyjnej pod wpływem pola magnetycznego. Stosuje się w tym celu polimery zawierające pułapkowane cząstki metali lub ich ferromagnetycznych tlenków albo granule tlenków tych metali aktywowanych g-aminopropylotrietoksysilanem lub pokrytych warstwą substancji wiążącej białka.
Liczną grupą produkowanych obecnie nośników są syntetyczne polimery i kopolimery o właściwościach i pojemności enzymatycznej (ilości białka związanego przez jednostkę masy nośnika) dostosowanych do projektowanego procesu. Należą do nich między innymi poliakryloamidy poliamidy, rozmaite pochodne polistyrenu, poliakrylonitrylu lub alkoholu poliwinylowego oraz zawierające grupy bezwodnikowe kopolimery bezwodnika maleinowego z etylenem albo styrenem. Podjęto także wiele prób stosowania nośników naturalnego pochodzenia, których zaletą jest niski koszt i wyeliminowanie niebezpieczeństwa zanieczyszczenia produktu pozostałością substancji służących do wytwarzania syntetycznych polimerów. Wykorzystuje się w tym celu rozmaite polisacharydy, białka i związki nieorganiczne, takie jak szkło porowate i żel krzemionkowy oferowany w handlu pod nazwami: Spherosil, Promaxon lub Aerosil. Wymienione nośniki wytwarzane sposobami zapewniającymi kontrolowaną liczebność i rozmiary porów, nie ulegają degradacji w szerokim zakresie pH i temperatury oraz są odporne na mikrobiologiczną degradację.
Dobrze zbadanym i łatwo dostępnym nośnikiem jest chitozan zawierający grupy aminowe, wiążące enzym za pośrednictwem wiązań jonowych lub wiązań kowalencyjnych wytwarzanych z udziałem aldehydu glutarowego. Skuteczność immobilizacji zależy od zawartości wolnych grup aminowych, którą można regulować zmianami stężenia, temperatury i czasu oddziaływania roztworu NaOH powodującego deacetylację chityny. Wadą chitozanu jako nośnika jest rozpuszczalność w kwaśnym środowisku. Ułatwia to jednak formowanie ziaren lub błon chitozanowych, polegające na strącaniu wymienionego biopolimeru z roztworu przeniesionego do alkalicznego środowiska. Rozpuszczalność tak uformowanego nośnika można następnie ograniczyć przez sieciowanie aldehydem glutarowym lub innymi substancjami.
6.4. Niektóre zastosowania
Jednym z wcześniejszych zastosowań immobilizowanego enzymu było wydzielanie L-aminokwasów polegające na hydrolizie tylko jednej N-acetylowej pochodnej znajdującej się w racemicznej mieszaninie N-acetylowanych aminokwasów. Reakcję katalizowano działającą stereoselektywnie aminoacylazą unieruchomioną na złożu DEAE-Sephadex, a uwolniony L-aminokwas oddzielano od cieczy poreakcyjnej przez krystalizację. Preparaty immobilizowanych enzymów charakteryzujących się stereospecyficznością mają duże znaczenie w przemyśle farmaceutycznym. Wynika to z bardzo zróżnicowanego niekiedy oddziaływania fizjologicznego poszczególnych enancjomerów stosowanej jako lek substancji, powodującego konieczność usunięcia niepożądanego składnika.
Innym przykładem zastosowań w przemyśle farmaceutycznym jest produkcja kwasu 6-aminopenicylinowego wytwarzanego z penicyliny w procesie katalizowanym immobilizowaną amidazą penicylinową. Stosowane do katalizowania procesu porcje preparatu enzymatycznego charakteryzują się dużą stabilnością operacyjną, umożliwiającą 1000-krotne ich użycie.
Immobilizowaną izomerazę ksylozową stosuje się od dość dawna w przepływowych reaktorach służących do wytwarzania fruktozy. Produkowane obecnie preparaty umożliwiają konwersję około 45 % glukozy znajdującej się w roztworze substratu. Wydajności procesu nie można zwiększyć ze względu na inaktywację enzymu w temperaturze przekraczającej 55-60 °C oraz z powodu wzrastającego zanieczyszczenia wytwarzanego syropu produktami reakcji ubocznych. Oddzielenie pozostałości glukozy odbywa się w kolumnie z kationitem adsorbującym fruktozę z której jest ona następnie wymywana wodą. Preparaty immobilizowanej izomerazy glukozowej są zazwyczaj eksploatowane przez 200-400 dni ale okres ten ulega skróceniu w przypadku nie usunięcia pozostałości białek z przetwarzanego syropu glukozowego lub z powodu mikrobiologicznego zanieczyszczenia reaktora. Zmniejszenie aktywności preparatu następuje także pod wpływem jonów Ca2+ działających jako inhibitor enzymu. Chromatograficznego wzbogacania produktu można uniknąć w przypadku znalezienia izomerazy o lepszej termostabilności, umożliwiającej zwiększenie stopnia konwersji przez podniesienie temperatury.
Immobilizowane b-galaktozydazy są przydatne do wytwarzania produktów mlecznych przeznaczonych dla ludzi cierpiących na nietolerancję laktozy lub syropów glukozowo-galaktozowych z permeatu serwatki. Innym korzystnym skutkiem hydrolizy tego disacharydu jest wyeliminowanie pogorszenia jakości produktów spowodowanego krystalizacją laktozy w obniżonej temperaturze, jej higroskopijnością i zdolnością do adsorbowania niepożądanych substancji zapachowych. Zastąpienie preparatów unieruchomionej b-galaktozydazy, stosowanych obecnie w ograniczonym zakresie do wytwarzania pozbawionego laktozy mleka i serwatki, ich odpowiednikami zawierającymi enzym pochodzący z psychrofili ograniczy ryzyko mikrobiologicznego zanieczyszczenia reaktora i cieplnej destrukcji termolabilnych składników produktu.
Prowadzone są obecnie badania preparatów immobilizowanej syntazy trehalozy. Enzym ten przekształcając występujące w maltozie wiązania a-1,4-glikozydowe umożliwia produkcję trehalozy (a-D-glukopiranozylo-1,1-a-glukopiranozydu) z łatwo dostępnych syropów maltozowych. Uzyskany disacharyd jest cennym produktem przydatnym w lecznictwie, przetwórstwie żywności oraz kosmetyce i farmacji. Nie udało się jeszcze uzyskać satysfakcjonującej wydajności procesu, bo zbadane dotychczas preparaty syntazy trehalozy z Thermus caldophilus, immobilizowanej na nośniku Eupergit C250L katalizowały w optymalnych warunkach konwersję około 42 % maltozy znajdującej się w środowisku reakcji.
Unieruchomione hydrolazy glikozydowe i enzymy modyfikujące lub tworzące wiązania glikozydowe służą do syntezy oligosacharydów o korzystnych właściwościach funkcjonalnych, leczniczych i prebiotycznych. Immobilizowane fruktozylotransferazy są między innymi stosowane w instalacjach przemysłowych służących do produkcji fruktooligosacharydów z sacharozy. Skład mieszaniny oligosacharydów wytwarzanej z udziałem unieruchomionych biokatalizatorów zależy od rodzaju enzymu i nośnika, czasu kontaktu substratu ze złożem oraz temperatury reakcji. Immobilizacja stabilizuje strukturę enzymu i zapobiega spadkowi aktywności w środowisku rozpuszczalników, dodawanych czasami w celu obniżenia aktywności wody, a w konsekwencji przyśpieszenia transglikozylacji lub odwrotnej hydrolizy.
Duże perspektywy ma zastosowanie immobilizowanych lipaz katalizujących reakcje hydrolizy, estryfikacji, transestryfikacji i regioselektywnej acylacji. Ich zaletą jest znaczna aktywność katalityczna w środowisku rozpuszczalników organicznych i na granicy faz różniących się polarnością. Immobilizowane lipazy są stosowane w przemyśle do produkcji strukturyzowanych lipidów, leków, substancji smakowo-zapachowych i emulgatorów. Przykładem strukturyzacji lipidów jest wytwarzanie substytutu masła kakaowego. Opatentowany przez firmy Unilever i Fui Oil proces polega na enzymatycznej transestryfikacji olejów: palmowego, słonecznikowego lub oliwkowego z udziałem tristearynoiloglicerolu jako donora grup acylowych. Immobilizowaną lipazę z Rhizomucor miehei zastosowano w koncernie Unichem International do wytwarzania estrów kwasów tłuszczowych (emolientów) służących w kosmetyce do pielęgnacji skóry. Spośród wielu zastosowań immobilizowanych lipaz należy wyróżnić prowadzoną w apolarnym środowisku syntezę estrów sacharydów używanych jako biodegradowalne surfaktanty oraz wytwarzanie nadtlenokwasów RCOOOH z kwasów karboksylowych utlenianych nadtlenkiem wodoru. Duże znaczenie praktyczne ma też przejawiana przez unieruchomione lipazy zdolność katalizowania reakcji przebiegających w środowisku płynów nadkrytycznych (SCF), którą wykorzystano między innymi do wytwarzania czystego enancjomerycznie ibuprofenu stosowanego jako lek przeciwzapalny i przeciwbólowy.
Unieruchomioną papainę, pepsynę lub neutrazę stosuje się w celu zapobiegania zmętnieniu piwa podczas przechowywania chłodniczego. Wymienione proteazy hydrolizują znajdujące się w piwie białka wytwarzając oligopeptydy i wolne aminokwasy mniej podatne na tworzenie kompleksów z polifenolami strącających się w obniżonej temperaturze. Zdolność proteaz do katalizowania syntezy wiązania amidowego wykorzystano w procesie przemysłowego wytwarzania aspartamu. Producenci tej niekalorycznej substancji słodzącej stosują preparaty unieruchomionej termolizyny. Syntetyzowany enzymatycznie dipeptyd zbudowany jest wyłącznie z kwasu L-asparaginowego i metylowego estru L-fenyloalaniny i nie zawiera reszt aminokwasowych o innej kofiguracji, powodujących ograniczenie słodkości aspartamu wytwarzanego metodami chemicznymi. Procesy enzymatyczne okazały się też przydatne do produkcji akrylamidu CH2=CHCONH2 z akrylonitrylu CH2CHCN i wody. Związek ten stosowany jako prekursor rozmaitych polimerów i flokulantów wytwarzano metodami chemicznymi, których wadą są niepożądane reakcje uboczne. Znacznie większą czystość produktu zapewnia proces katalizowany hydratazą nitrylową z Rhodococcus rhodochrous wykorzystywany obecnie do produkcji akrylamidu w skali ponad 15 000 ton rocznie.
Odmiennym sposobem wykorzystania enzymów unieruchomionych w mikrokapsułkach jest ich użycie jako składnika proszków do prania. Otoczka mikrokapsułki służy w tym przypadku jako bariera zabezpieczająca enzym przed inaktywującym oddziaływaniem innych składników detergentu podczas jego przechowywania i powinna ulegać destrukcji po wprowadzeniu środka piorącego do wody.
Immobilizowane enzymy znalazły też duże ...
Elesmera