Wykład III.docx

(153 KB) Pobierz

Podstawy transgenezy zwierząt (wykład III) Przygotowanie do modyfikacji genomu

v      Linie zarodkowych komórek pnia myszy

Ø      Wybór linii ES

§         Tło genetyczne

·         Zwykle nie jest problemem

·         Przy homologicznej rekombinacji do modyfikacji komórek ES jest bardzo ważne

§         Płodność uzyskanych chimer oraz wydajność transmisji do linii płciowej danej linii

·         Problem komórek ES ze szczepów wsobnych

§         Kolorystyka uzyskanych chimer

§         Metoda selekcji przypadków przeniesienia do linii płciowej

·         Germline transmission

·         Układ allel recesywny/dominująca

§         Gdzie zakupić komórki ES

·         ATCC

·         Open Biosystem

·         Jackson Laboratories

·         Millipore

·         Primogenix

·         Predictive Biology

·         Tactonic Farms

·         Invitrogene

·         Stratagene

Ø      Materiał genetyczny używany do transgenezy

§         Zmiana w genomie poprzez homologiczną rekombinację

¨       Wymaga homologii rekombinujących sekwencji

·         Region homologiczny powinien pochodzić z tego samego szczepu zwierzęcia co komórka, której genom ma być zmodyfikowany

¨       Zachowanie identycznej sekwencji (izogenicznej)

v      Przygotowanie do docelowej modyfikacji genu (gene targeting)

Ø      Identyfikacja GOI

§         Gene of interest

Ø      Analiza struktury genu w bazach danych

§         Odpowiedź na pytanie co można zmodyfikować

Ø      Zakup kostruktu do modyfikacji genu lub przygotowanie do samodzielnego skonstruowania wektora docelowego

§         Uzyskanie sekwencji DNA dla GOI

·         Jeśli możliwe - w bazach danych

·         Uzyskać bibliotekę genową (cDNA) zawierającą GOI

¨       Poddać sekwencjonowaniu lub ustaleniu pozycji podstawowych miejsc restrykcyjnych

§         Uzyskanie sekwencji plazmidu

¨       Do stworzenia wektora docelowego

§         Złożenie wektora docelowego in silico

Ø      Przygotowanie strategii służącej identyfikacji wprowadzonej zmiany w genomie

Ø      Przygotowanie strategii genotypowania myszy transgenicznych

v      Analiza cytogenetyczna

Ø      Kariotyp

·         Obraz/fotografia układu sparowanych homologicznych chromosomów metafazowych komórki ukazująca ich liczbę, rozmiar i kształt

·         Chromosomalny skład komórki, osobnika, grupy osobników, zdefiniowany przez liczbę i morfologię chromosomów zwykle w metafazie mitozy i zwykle przedstawiany pod postacią skrótu

¨       46, XY

¨       Syndrom Downa – 47, XY + 21

§         W szczepach wsobnych

·         Wykrywanie nieprawidłowo zachodzącego procesu crossing-over

§         W hodowli komórek ES

·         Wykrywanie gromadzących się wraz z ilością pasaży mutacji

¨       Trisomie

¨       Monosomie

¨       Translokacje

·         Wykrywanie utraty chromosomów Y

¨       Komórki X0 dają fenotyp żeński u myszy

§         Uzyskiwanie

·         Blokowanie chromosomów metafazowych za pomocą kolchicyny i wybarwianie

Ø      Barwienie ASG (acetic-saline-Giemsa)

¨       Charakterystyczne prążkowanie, specyficzne dla każdego chromosomu

¨       Identyfikacja chromosomów oparta głównie na rozkładzie prążków G

Ø      G-banded kariotype

¨       Wykrywanie nieobecnych, dodatkowych, uszkodzonych chromosomów, delecji, insercji i translokacji

Ø      Małe duplikacje czy delecje nie są wykrywane

¨       Problem z chromosomem mysim

Ø      Wszystkie chromosomy są telocentryczne

§         Centrosom jest na jednym końcu

Ø      Małe różnice wielkości między chromosomami

Ø      Różnice długości chromosomów między szczepami myszy

¨       Odczytywanie wymaga wysokiej specjalizacji

·         FISH

¨       Użycie wyznakowanej jednoniciowej sondy do wykrycia i zlokalizowania docelowej sekwencji DNA lub RNA w tkance lub chromosomie

Ø      Zależnie od powiększenia

¨       Sonda znakowana za pomocą haptenów skompleksowanych z nukleotydami

Ø      FITC, Cy3, biotyna, DIG zwykle z UTP

Ø      Wykrywane przeciwciałami lub fluorescencyjne

¨       Sondy DNA do identyfikacji chromosomów (kariotypowanie)

Ø      Specyficzne gatunkowo sekwencje powtórzeń

§         Transpozony LINEs

·         L1 ~15% genomu człowieka

·         U myszy także stanowi duży procent genomu

§         Transpozony SINEs

·         AluI ~11% genomu człowieka

Ø      Farby chromosomalne

§         Złożona mieszanka sekwencji unikalnych DNA uzyskanych z całej długości chromosomu

§         Unikalna identyfikacja całego chromosomu

Ø      Sondy P1

§         Uzyskane z klonów mapujących regiony centromeru i telomerów

§         Mogą być używane razem z farbami chromosomalnymi

¨       Sondy DNA do identyfikacji genów

Ø      Analiza postmodyfikacyjna

Ø      Wykrywanie i określanie ilości kopii transgenu

¨       Zastosowania FISH

Ø      Wykrywanie translokacji i innych nieprawidłowości chromosomalnych

§         Umożliwione przez niejednoczesne odczytywanie wyniku

Ø      Identyfikacja pozycji transgenu w genomie

v      Zjawiska mogące utrudniać analizę uzyskanej modyfikacji

§         Podczas wprowadzania modyfikacji organizm może zmodyfikować się sam

Ø      Spontaniczne modyfikacje genomu

§         Mutacje punktowe

§         Aberracje chomosomalne

§         Transpozony

·         Przemieszczanie się

·         Metylacja

Ø      Regulacja epigenetyczna

§         Zmiany w DNA (poza zmianami w sekwencji DNA), białkach związanych z DNA, w RNA oraz białkach niezwiązanych z DNA, które mogą wpływać na ekspresję genomu (fenotyp komórki)

·         Metylacja DNA, remodelowanie chromatyny, inaktywacja chromosomu X, transpozony

·         Zachodzi w trakcie embriogenezy, procesach chorobowych i starzeniu się

§         Zagęszczenie metylowanych transpozonów w danym rejonie wpływa negatywnie na ekspresję sąsiadujących genów

·         zmetylowane z powodu obecności silnych promotorów między innymi transpozazy – po zmetylowaniu nie przemieszczają się

·         Zwykle są elementem heterochromatyny

¨       Heterochromatyna ma tendencję do rozprzestrzeniania się do sekwencji ogranicznikowych

·         W modyfikowanym embrionie najwięcej jest euchromatyny, gdzie transgen wbudowuje się z największym prawdopodobieństwem

¨       Genom embrionu w trakcie rozwoju zaczyna się kondensować

¨       Transgen może zostać elementem heterochromatyny

Ø      Brak ekspresji transgenu

·         Poziom metylacji jest zależny od odżywiania matki

¨       Dostarczanie elementów potrzebnych do wytworzenia reszt metylowch

§         Retrotranspozony mogą pobudzać ekspresję z wyciszonych promotorów

·         Jeśli nie zostanie zmetylowany może nastąpić nadekspresja produktu pod kontrolą promotora transpozonu

§         Imprinting/znakowanie genów – ...

Zgłoś jeśli naruszono regulamin