Podstawy transgenezy zwierząt (wykład III) Przygotowanie do modyfikacji genomu
v Linie zarodkowych komórek pnia myszy
Ø Wybór linii ES
§ Tło genetyczne
· Zwykle nie jest problemem
· Przy homologicznej rekombinacji do modyfikacji komórek ES jest bardzo ważne
§ Płodność uzyskanych chimer oraz wydajność transmisji do linii płciowej danej linii
· Problem komórek ES ze szczepów wsobnych
§ Kolorystyka uzyskanych chimer
§ Metoda selekcji przypadków przeniesienia do linii płciowej
· Germline transmission
· Układ allel recesywny/dominująca
§ Gdzie zakupić komórki ES
· ATCC
· Open Biosystem
· Jackson Laboratories
· Millipore
· Primogenix
· Predictive Biology
· Tactonic Farms
· Invitrogene
· Stratagene
Ø Materiał genetyczny używany do transgenezy
§ Zmiana w genomie poprzez homologiczną rekombinację
¨ Wymaga homologii rekombinujących sekwencji
· Region homologiczny powinien pochodzić z tego samego szczepu zwierzęcia co komórka, której genom ma być zmodyfikowany
¨ Zachowanie identycznej sekwencji (izogenicznej)
v Przygotowanie do docelowej modyfikacji genu (gene targeting)
Ø Identyfikacja GOI
§ Gene of interest
Ø Analiza struktury genu w bazach danych
§ Odpowiedź na pytanie co można zmodyfikować
Ø Zakup kostruktu do modyfikacji genu lub przygotowanie do samodzielnego skonstruowania wektora docelowego
§ Uzyskanie sekwencji DNA dla GOI
· Jeśli możliwe - w bazach danych
· Uzyskać bibliotekę genową (cDNA) zawierającą GOI
¨ Poddać sekwencjonowaniu lub ustaleniu pozycji podstawowych miejsc restrykcyjnych
§ Uzyskanie sekwencji plazmidu
¨ Do stworzenia wektora docelowego
§ Złożenie wektora docelowego in silico
Ø Przygotowanie strategii służącej identyfikacji wprowadzonej zmiany w genomie
Ø Przygotowanie strategii genotypowania myszy transgenicznych
v Analiza cytogenetyczna
Ø Kariotyp
· Obraz/fotografia układu sparowanych homologicznych chromosomów metafazowych komórki ukazująca ich liczbę, rozmiar i kształt
· Chromosomalny skład komórki, osobnika, grupy osobników, zdefiniowany przez liczbę i morfologię chromosomów zwykle w metafazie mitozy i zwykle przedstawiany pod postacią skrótu
¨ 46, XY
¨ Syndrom Downa – 47, XY + 21
§ W szczepach wsobnych
· Wykrywanie nieprawidłowo zachodzącego procesu crossing-over
§ W hodowli komórek ES
· Wykrywanie gromadzących się wraz z ilością pasaży mutacji
¨ Trisomie
¨ Monosomie
¨ Translokacje
· Wykrywanie utraty chromosomów Y
¨ Komórki X0 dają fenotyp żeński u myszy
§ Uzyskiwanie
· Blokowanie chromosomów metafazowych za pomocą kolchicyny i wybarwianie
Ø Barwienie ASG (acetic-saline-Giemsa)
¨ Charakterystyczne prążkowanie, specyficzne dla każdego chromosomu
¨ Identyfikacja chromosomów oparta głównie na rozkładzie prążków G
Ø G-banded kariotype
¨ Wykrywanie nieobecnych, dodatkowych, uszkodzonych chromosomów, delecji, insercji i translokacji
Ø Małe duplikacje czy delecje nie są wykrywane
¨ Problem z chromosomem mysim
Ø Wszystkie chromosomy są telocentryczne
§ Centrosom jest na jednym końcu
Ø Małe różnice wielkości między chromosomami
Ø Różnice długości chromosomów między szczepami myszy
¨ Odczytywanie wymaga wysokiej specjalizacji
· FISH
¨ Użycie wyznakowanej jednoniciowej sondy do wykrycia i zlokalizowania docelowej sekwencji DNA lub RNA w tkance lub chromosomie
Ø Zależnie od powiększenia
¨ Sonda znakowana za pomocą haptenów skompleksowanych z nukleotydami
Ø FITC, Cy3, biotyna, DIG zwykle z UTP
Ø Wykrywane przeciwciałami lub fluorescencyjne
¨ Sondy DNA do identyfikacji chromosomów (kariotypowanie)
Ø Specyficzne gatunkowo sekwencje powtórzeń
§ Transpozony LINEs
· L1 ~15% genomu człowieka
· U myszy także stanowi duży procent genomu
§ Transpozony SINEs
· AluI ~11% genomu człowieka
Ø Farby chromosomalne
§ Złożona mieszanka sekwencji unikalnych DNA uzyskanych z całej długości chromosomu
§ Unikalna identyfikacja całego chromosomu
Ø Sondy P1
§ Uzyskane z klonów mapujących regiony centromeru i telomerów
§ Mogą być używane razem z farbami chromosomalnymi
¨ Sondy DNA do identyfikacji genów
Ø Analiza postmodyfikacyjna
Ø Wykrywanie i określanie ilości kopii transgenu
¨ Zastosowania FISH
Ø Wykrywanie translokacji i innych nieprawidłowości chromosomalnych
§ Umożliwione przez niejednoczesne odczytywanie wyniku
Ø Identyfikacja pozycji transgenu w genomie
v Zjawiska mogące utrudniać analizę uzyskanej modyfikacji
§ Podczas wprowadzania modyfikacji organizm może zmodyfikować się sam
Ø Spontaniczne modyfikacje genomu
§ Mutacje punktowe
§ Aberracje chomosomalne
§ Transpozony
· Przemieszczanie się
· Metylacja
Ø Regulacja epigenetyczna
§ Zmiany w DNA (poza zmianami w sekwencji DNA), białkach związanych z DNA, w RNA oraz białkach niezwiązanych z DNA, które mogą wpływać na ekspresję genomu (fenotyp komórki)
· Metylacja DNA, remodelowanie chromatyny, inaktywacja chromosomu X, transpozony
· Zachodzi w trakcie embriogenezy, procesach chorobowych i starzeniu się
§ Zagęszczenie metylowanych transpozonów w danym rejonie wpływa negatywnie na ekspresję sąsiadujących genów
· Są zmetylowane z powodu obecności silnych promotorów między innymi transpozazy – po zmetylowaniu nie przemieszczają się
· Zwykle są elementem heterochromatyny
¨ Heterochromatyna ma tendencję do rozprzestrzeniania się do sekwencji ogranicznikowych
· W modyfikowanym embrionie najwięcej jest euchromatyny, gdzie transgen wbudowuje się z największym prawdopodobieństwem
¨ Genom embrionu w trakcie rozwoju zaczyna się kondensować
¨ Transgen może zostać elementem heterochromatyny
Ø Brak ekspresji transgenu
· Poziom metylacji jest zależny od odżywiania matki
¨ Dostarczanie elementów potrzebnych do wytworzenia reszt metylowch
§ Retrotranspozony mogą pobudzać ekspresję z wyciszonych promotorów
· Jeśli nie zostanie zmetylowany może nastąpić nadekspresja produktu pod kontrolą promotora transpozonu
§ Imprinting/znakowanie genów – ...
Rainhardt